黃 姣霍錦倩劉 姣陳 潔祖 堯張慶華任建峰?

(1.上海海洋大學(xué) 科技部海洋生物科學(xué)國際聯(lián)合研究中心,上海 201306;2.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室,上海 201306;3.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)科學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心,上海 201306)

糖原是由葡萄糖結(jié)合而成的一種支鏈動物淀粉多糖,被作為能量代謝葡萄糖單位的儲存庫[1-2],主要儲存在心臟、肌肉和肝。 糖原貯積癥(glycogen storage disease, GSD)是一組常染色體遺傳疾病,患者糖原合成或分解正常代謝受到影響,而引起的疾病[3],主要表現(xiàn)為肌肉、心臟、腦和肝中糖原代謝異常[4]。 根據(jù)缺陷的酶和影響的組織至少可分為16種類型[5]。 GSD 的臨床表現(xiàn)缺乏特異性,累及骨骼肌主要表現(xiàn)為肌無力、運動不耐受、肌痛、肌溶解和萎縮,累及心肌表現(xiàn)為心肌病,累及肝主要表現(xiàn)為低血糖和肝腫大[4]。

哺乳動物糖原合酶(glycogen synthase, GYS)有兩種亞型,即肌型糖原合酶和肝型糖原合酶,分別由GYS1 和GYS2 基因編碼[1],GYS基因表達(dá)具有組織特異性,GYS1 主要在骨骼肌和心肌表達(dá),此外還在腦、腎和脂肪組織中表達(dá)[6],而GYS2 則在肝中特異性表達(dá)[7]。 肌糖原主要作用是為肌肉收縮運動提供能量。 肝糖原主要作用是維持血糖平衡,當(dāng)沒有足夠的葡萄糖時,肝糖原轉(zhuǎn)化為葡萄糖,釋放到血液中,防止低血糖[8]。 人類GYS2 基因突變會導(dǎo)致肝糖原合成失敗,而GYS1 基因突變則會導(dǎo)致肌糖原合成失敗,兩者突變導(dǎo)致的糖原貯積癥疾病分別稱為GSD0a 型和GSD0b 型[9]。

GSD0 型疾病自1963 年Lewis 發(fā)現(xiàn)以來,臨床病例報道不足40 例,主要是GSD0a 型,GSD0b 型病例非常少。 一例GSD0b 型病例報道,三兄妹GYS1基因發(fā)生無義突變(R462X),10.5 歲的哥哥在戶外運動時死于心臟驟停,尸檢報告顯示為肥厚性心肌病;2 年后,死者的弟弟出現(xiàn)同哥哥相似的肥厚性心肌病癥狀、并伴有運動時心率和血壓異常等癥狀[10]。 另一GSD0b 型病例報道,一女兒童患者5歲開始反復(fù)發(fā)作暈厥,并伴有肌肉無力和疼痛癥狀,12 歲時死于心臟驟停[2]。

GSD 病由基因突變所致,所以缺乏有效的治愈方法和手段,目前主要通過飲食管理和康復(fù)訓(xùn)練等措施干預(yù),緩解疾病癥狀,避免低血糖、高乳酸血癥、高尿酸血癥和高脂血癥等的發(fā)生[9]。 GSD0 疾病模型基礎(chǔ)研究上,Pederson 等[1]構(gòu)建了Gys1 基因敲除小鼠模型,該小鼠肌肉和心臟等組織缺乏糖原儲備,90%的小鼠出生后死于心功能受損,其心臟整體變小。 Xirouchaki 等[11]構(gòu)建了肌肉特異性Gys1基因敲除小鼠,該小鼠肌肉中Gys1 基因mRNA 和蛋白濃度降低85%以上,糖原含量下降70%,餐后高血糖和葡萄糖耐量下降;在胰島素刺激下,該小鼠的葡萄糖代謝和肌肉葡萄糖攝取下降,運動和耐力也明顯下降。 Irimia 等[12]構(gòu)建了肝特異性Gys2 基因敲除小鼠,該小鼠能夠存活,肝糖原合酶發(fā)生缺陷,肝糖原含量下降了95%,并出現(xiàn)了輕微的低血糖癥狀,該模型很好地模擬了GSD0a 病理生理學(xué)。

斑馬魚(Danio rerio)具有世代周期短、子代多、胚胎透明、易進(jìn)行實驗操作等優(yōu)點,已成為繼小鼠之后研究器官發(fā)育及疾病模型構(gòu)建等的一種新型模式動物[13]。 本研究利用CRISPR/Cas9 技術(shù)成功構(gòu)建了斑馬魚gys1 和gys2 突變體,期望通過斑馬魚糖原貯積癥模型的建立,為進(jìn)一步研究糖原貯積癥的發(fā)病機(jī)制和詳細(xì)進(jìn)程提供材料。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

斑馬魚野生型AB 品系購自中國科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心斑馬魚平臺,養(yǎng)殖在循環(huán)水系統(tǒng)中,水溫26℃~28℃,光照周期為14 h 明/10 h暗。 受精后5 d 的幼魚開始投喂草履蟲,受精后15 d 的幼魚開始投喂豐年蟲。 所有實驗均按照上海海洋大學(xué)動物倫理委員會的規(guī)定(SHOU-DW-2016-001)進(jìn)行操作。

1.2 主要試劑與儀器

gRNA 骨架體外轉(zhuǎn)錄模板pUC19-scaffold 質(zhì)粒由北京大學(xué)熊敬維教授惠贈;MAXIscript? T7 體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(Ambion, AM1314)購自賽默飛世爾科技公司;NLS-Cas9-NLS 蛋白(GenScript, Z03389-100)購自南京金斯瑞生物科技有限公司;T7EI 內(nèi)切酶(NEB, M0302L)和Phusion? 高保真PCR 反應(yīng)預(yù)混液(NEB, M0531L)購自NEB(北京)有限公司;PrimeScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa, RR047A)購自大連寶生物公司;LightCycler? 480 SYBR Green I熒光定量PCR 反應(yīng)液(Roche, 04887352001)購自羅氏生命科學(xué)公司;糖原PAS 染色液試劑盒(G1281)購自北京索萊寶科技有限公司。

體式顯微鏡(SteREO Discovery. V8)和正置熒光顯微鏡(Axio Imager2)均為Zeiss 公司產(chǎn)品;微量注射泵(PLI-100A Plus)為美國Warner Instruments公司產(chǎn)品;實時熒光定量PCR 系統(tǒng)(LightCycler?480II)為羅氏生命科學(xué)公司產(chǎn)品。

1.3 實驗方法

1.3.1 基因敲除靶點設(shè)計和gRNA 合成

從Ensembl 斑馬魚數(shù)據(jù)庫(http:/ /asia.ensembl.org/Danio_rerio/Info/Index)下載gys1 和gys2 基因組序列。 利用zifit 網(wǎng)站(http:/ /zifit.partners.org/ZiFiT/),在盡量靠近起始密碼子ATG 的外顯子序列上搜索靶點位置,所有靶點序列與斑馬魚基因組序列進(jìn)行BLAST(https:/ /blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比對,選擇序列特異性好的靶點。

利用T7 啟動子體外轉(zhuǎn)錄合成靶點gRNA。分別利用gys1 上游引物: 5’-TAATACGACTCACT ATAGGGCTTCACGGCCTGGTCTC GTTTTAGAGCTAG AAATAGC-3’,gys2 上游引物: 5 ’-TAATACG ACTCACTATAGGAACCTGGACCGCTGGAAG GTTTTA GAGCTAGAAATAGC-3’;和下游通用引物: 5’-AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC-3 ’,擴(kuò)增pUC19-scaffold 質(zhì)粒。 然后以PCR 產(chǎn)物作為模板,體外轉(zhuǎn)錄合成靶點gRNA。

1.3.2 基因敲除F0嵌合體的制備

進(jìn)行繁殖的親本純合子篩選。 其實驗步驟如下,選取性成熟的野生型斑馬魚雌雄各10 尾,利用堿裂解法提取尾鰭組織基因組DNA,利用靶點上下游引物(表1)擴(kuò)增PCR,擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序分析。所有檢測個體序列一致的親本為純合子。

在受精卵1 細(xì)胞期進(jìn)行顯微注射并進(jìn)行基因敲除效率的檢測。 將1 nL Cas9 蛋白和gRNA 的混合物(800 ng/μL:100 ng/μL)注射入受精卵。 注射組和對照組胚胎置于培養(yǎng)箱中孵化,溫度保持在28.5℃。 取2 dpf(days post fertilization)的胚胎(混合5 枚胚胎為1 組,取3 組平行樣品),采用堿裂解法提取基因組DNA,利用表1 引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,然后進(jìn)行敲除效率檢測。 25 μL PCR 反應(yīng)體系如下, DNA 模板2.0 μL,上下游引物各1.0 μL,2×Easy Taq? PCR 反應(yīng)預(yù)混液12.5 μL,ddH2O 補(bǔ)齊至25 μL。 PCR 反應(yīng)程序如下:94℃預(yù)變性3 min;94℃30 s,60℃30 s,72℃40 s,共33 個循環(huán),72℃再延伸5 min。

表1 靶點及檢測引物序列信息Table 1 Information of target sites and detecting primer sequences

分別采用T7E1 酶切法和Sanger 測序法檢測基因敲除效率。 首先,將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行T7E1 酶切,然后進(jìn)行電泳分析。 根據(jù)電泳條帶灰度值,參照公式100×(1-sqrt(1-(b+c)/(a+b+c)))估算基因敲除效率,a 為未切開條帶灰度值,b 和c 分別為切開條帶的灰度值[14]。 通過Sanger 測序法進(jìn)一步確認(rèn)基因敲除是否成功,將酶切成功的PCR 產(chǎn)物測序,若靶點處及以后出現(xiàn)套峰,則證明基因敲除成功。

1.3.3 純合突變體的篩選及表型分析

F1基因突變類型篩選。 將性成熟的F0成魚與野生型成魚進(jìn)行外交獲得F1,待F1達(dá)到2 月齡時,采用同基因敲除效率檢測的流程,進(jìn)行F1基因突變類型篩選。 提取F1尾鰭基因組DNA,進(jìn)行PCR 擴(kuò)增和產(chǎn)物T7E1 酶切,酶切成功的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆測序,確定每尾F1基因突變類型,并篩選發(fā)生移碼突變的個體。

F2純合突變體篩選。 將具有相同突變類型的F1雜合子成魚進(jìn)行內(nèi)交,獲得不同突變類型的F2。采用同基因敲除效率檢測的流程,進(jìn)行F2個體基因型鑒定。 提取F2成魚尾鰭基因組DNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,并將產(chǎn)物進(jìn)行T7E1 酶切分析。 產(chǎn)物切開對應(yīng)的個體為雜合子,產(chǎn)物未切開對應(yīng)的個體為野生型或純合突變體,將產(chǎn)物未切開對應(yīng)的個體通過測序進(jìn)一步確定其基因型。 F2純合突變體內(nèi)交獲得F3,仔細(xì)觀察F2和F3表型。

1.3.4 突變體糖原累積情況檢測

通過PAS 染色法檢測糖原在組織中的累積情況。 收集野生型和純合突變體成魚的心臟、肌肉和肝組織,用10%福爾馬林固定24 h 后進(jìn)行石蠟切片。 按照試劑盒使用說明進(jìn)行糖原染色操作。 石蠟切片染色后進(jìn)行逐級乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片,光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.5 不同發(fā)育時期和不同組織基因表達(dá)分析

對胚胎或幼魚不同發(fā)育時期和成魚不同組織的gys1 和gys2 基因表達(dá)水平進(jìn)行檢測。 選取斑馬魚胚胎或幼魚早期發(fā)育的15 個時期和野生型成魚的12 個組織,包括腦、眼睛、鰓、心臟、肌肉、皮膚、肝、脾、腸、腎、卵巢和精巢,進(jìn)行基因表達(dá)水平分析,每種樣品取3 個生物學(xué)重復(fù)。 利用TRIzol 法提取所有樣本總RNA 備用。

將總RNA 反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,利用NCBI 網(wǎng)站在線程序設(shè)計gys1 和gys2 基因qRT-PCR 引物,引物序列見表2,使用羅氏LightCycler? 480II 熒光定量PCR 進(jìn)行基因表達(dá)量分析。 內(nèi)參基因選擇斑馬魚β-actin,基因相對表達(dá)量采用2-ΔΔct法計算,基因表達(dá)圖利用Graphpad prism5 軟件繪制。

表2 qRT-PCR 引物序列Table 2 Primer sequences for qRT-PCR

2 結(jié)果

2.1 基因敲除靶點設(shè)計及序列分析

分別在gys1 和gys2 基因外顯子上設(shè)計一個靶點,gys1 的正向靶點位于基因第4 個外顯子上(圖1a),gys2 的正向靶點位于基因的第3 個外顯子上(圖1b)。 將斑馬魚gys1 和gys2 基因編碼蛋白序列與小鼠及人類同源基因編碼的蛋白序列進(jìn)行相似性分析。 結(jié)果顯示,GYS 蛋白序列在人、小鼠和斑馬魚3 物種中高度保守(圖1c~1d),斑馬魚Gys1 與小鼠和人蛋白的氨基酸序列一致性達(dá)到92%,斑馬魚Gys2 與小鼠和人蛋白氨基酸序列一致性達(dá)到89%。

圖1 斑馬魚gys1 和gys2 基因敲除靶點示意圖及編碼蛋白序列相似性分析Note. (a-b), The gene structures of gys1 and gys2 and the sequences and locations of the target sites. The red box indicates the Cas9 protein recognized PAM (protospacer adjacent motif)region. (c-d), The alignment of amino acid sequences of GYS1 and GYS2 between human, mouse, and zebrafish.Figure 1 Schematic diagram of target sites of gys1 and gys2 and the sequence alignment of GYS1 and GYS2 between human, mouse and zebrafish

2.2 F0 嵌合體基因敲除效率檢測

混合F0胚胎基因敲除效率T7E1 酶切法檢測結(jié)果顯示,gys1 基因編輯3 組平行實驗的敲除效率分別是66%、55%和53%(圖2a),gys2 基因編輯3組平行實驗的敲除效率分別是0%、56%和63%(圖2c)。 酶切成功的PCR 產(chǎn)物進(jìn)一步通過Sanger 測序法檢測,結(jié)果顯示靶點處及以后出現(xiàn)套峰現(xiàn)象(圖2b、2d),表明基因敲除成功。

圖2 斑馬魚gys1 和gys2 基因敲除T7E1 酶切檢測和Sanger 法測序檢測Note.(a), The assay of knockout efficiency for gys1 by T7E1 enzyme digestion.(b),The assay of knockout for gys1 by Sanger sequencing. (c),The assay of knockout efficiency for gys2 by T7E1 enzyme digestion. (d), The assay of knockout for gys2 by Sanger sequencing. The boxes indicate the target sites and PAM sites, respectively.Figure 2 Gene knockout of gys1 and gys2 assayed with T7E1 digestion and Sanger sequencing in zebrafish

2.3 純合突變體F2 的篩選

將基因編輯引起突變的F0與野生型外交獲得F1,在約2 月齡時,通過T7E1 酶切檢測的方法篩選F1雜合子。 在54 尾gys1 F1中篩選到28 尾雜合子(圖3a),在54 尾gys2 F1中篩選到19 尾雜合子(圖3b)。 F1雜合子通過TA 克隆測序的方法篩選有效基因突變類型,gys1 雜合子篩選出4 種有效突變類型(圖3c),gys2 雜合子篩選出3種有效突變類型(圖3d)。

分別將gys1 兩種突變類型(-7 bp 和+13,-2 bp)和gys2 兩種突變類型(-4 bp 和+4,+19,+17 bp)F1內(nèi)交獲得F2。 對F2個體基因型和數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計分析,結(jié)果顯示,野生型、雜合型和純合型3種基因型存活個體數(shù)量比例接近1 ∶2 ∶1,卡方檢驗分析無顯著性差異(表3),符合孟德爾分離定律,表明gys1 和gys2 F2純合子不存在胚胎致死表型。

表3 gys1 和gys2 不同基因型F2 個體數(shù)目卡方檢驗分析Table 3 Chi-square test of different genotypes of gys1 and gys2 F2

gys1 和gys2 基因分別編碼700 和703 個氨基酸。gys1 兩種突變類型純合子基因編碼的蛋白分別截短至267 和124 個氨基酸。gys2 兩種突變類型純合子基因編碼的蛋白分別截短至164 和194 個氨基酸(圖3e~3f)。

圖3 斑馬魚gys1 和gys2 突變體F1 和F2 篩選及突變類型Note.(a), T7E1 screening of gys1 F1heterozygotes.(b), T7E1 screening of gys2 F1 heterozygotes.(c-d), The mutation type of gys1 and gys2 detected by Sanger sequencing.(e-f), The schematic diagrams showing the truncated proteins of two mutation type of gys1 and gys2 genes.Figure 3 Screening of heterozygous F1 and homozygous F2 of gys1 and gys2 and the representation of mutation type andtruncated protein sequences

2.4 純合子F2 及其后代F3 表型分析

與野生型相比,gys1 和gys2 兩種突變類型的F2純合子在生長發(fā)育過程中未發(fā)現(xiàn)異常表型。gys1-/-F2自交后代F3早期胚胎發(fā)育缺陷,48 hpf 內(nèi)全部死亡,而gys2-/-F2自交后代F3發(fā)育正常。 對野生型和gys1-/-F3早期胚胎發(fā)育7 個時間點(0、6、12、24、30、36 和48 hpf)胚胎存活和死亡數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計。結(jié)果顯示,野生型胚胎發(fā)育至24 hpf 后不再死亡,而gys1-/-F3胚胎至48 hpf 內(nèi)全部死亡,且死亡數(shù)量主要集中在0 ~ 24 hpf 時間段內(nèi)(圖4a ~ 4b)。 對gys1-/-F3與野生型胚胎24 hpf 內(nèi)重要發(fā)育時期比較發(fā)現(xiàn),與野生型相比,gys1-/-F3胚胎從0.5 hpf 開始發(fā)育延遲;8 hpf 時候,相對野生型延遲發(fā)育約2 h;24 hpf 時候,相對野生型延遲發(fā)育約3 h(圖4c)。

圖4 gys1-/-純合子F2 及其后代F3 表型分析Note.(a), The statistics of dead embryos of gys1-/- F3 and WT during the period from 0 to 48 hpf. (b), The number of survival embryos of gys1-/- F3 and WT during the period from 0 to 48 hpf. (c), Observation of embryonic development of F3 and WT during 0~24 hpf.Figure 4 Phenotypic analysis of gys1-/- F2 and their offspring F3

2.5 gys1 和gys2 早期發(fā)育階段表達(dá)模式分析

gys1-/-內(nèi)交產(chǎn)生的后代胚胎發(fā)育異常,推測gys1 基因在斑馬魚胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要的作用。因此,利用qRT-PCR 技術(shù)檢測了gys1 和gys2 基因早期發(fā)育階段表達(dá)情況,結(jié)果顯示,gys1 基因在早期發(fā)育過程中呈現(xiàn)先下降再升高的趨勢,且在1細(xì)胞期表達(dá)量最高,尾芽期(bud stage)和12 hpf降到最低,然后升高,125 hpf 時達(dá)到1 細(xì)胞期30%(圖5a);gys2 與gys1 表達(dá)模式相似,但是gys2 的表達(dá)量低于gys1 表達(dá)量,約為gys1 表達(dá)量的一半(圖5b)。

圖5 gys1 和gys2 基因在野生型斑馬魚早期發(fā)育階段表達(dá)模式Figure 5 The expression pattern of gys1 (a)and gys2 (b)during early developmental stages

2.6 gys1 和gys2 組織表達(dá)譜和糖原染色分析

對成魚不同組織gys1 和gys2 基因表達(dá)情況進(jìn)行了定量分析,結(jié)果顯示gys1 在所有組織中均有表達(dá),其中在肌肉組織中的表達(dá)量最高(圖6a);而gys2 肝中表達(dá)最高,是其它組織表達(dá)量的50~100倍(圖6b)。

對gys1 和gys2 突變體與野生型的糖原染色分析顯示,與野生型相比,gys1-/-心臟和肌肉中沒有明顯糖原累積,而肝卻沒有明顯差別;gys2-/-肝中糖原累積量顯著降低,而心臟和肌肉沒有明顯變化(圖6c)。

圖6 gys1 和gys2 基因在野生型成魚組織表達(dá)譜及突變體組織糖原染色Note. (a-b), The expression pattern of gys1 and gys2 in different adult tissues of WT zebrafish. (c), The comparison of glycogen storage in heart,muscle and liver tissues between WT and mutants of gys1-/- and gys2-/- through PAS staining. The red asterisk indicates glycogen storage.Figure 6 Expression pattern of gys1 and gys2 in different adult tissues of WT zebrafish and PAS staining of different mutant tissues

3 討論

動物疾病模型的構(gòu)建對于研究人類疾病的發(fā)病機(jī)理和藥物篩選具有重要作用。 基因編輯技術(shù)是一種精準(zhǔn)、快速的人工基因突變技術(shù)手段。 基因編輯技術(shù)主要經(jīng)歷了3 個技術(shù)發(fā)展階段,分別是鋅指核酸酶(ZFNs, zinc-finger nucleases)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶( TALENs, transcription activator - like effector nucleases ) 和 CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)技術(shù)[15]。 其中,CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)因其操作簡單,成本低、效率高等特點,現(xiàn)已發(fā)展成為應(yīng)用最廣泛的基因編輯技術(shù)[16]。 斑馬魚具有繁殖周期短,產(chǎn)卵量大,胚胎透明,基因組與人類基因組相似性高等特點[17],已成為繼果蠅、線蟲和小鼠之后的又一種重要的模式動物。 通過CRISPR/Cas9 技術(shù)構(gòu)建斑馬魚疾病模型為研究人類疾病發(fā)病機(jī)理和篩選有效藥物提供了有效途徑。 糖原貯積癥是一組遺傳性先天糖代謝酶缺陷導(dǎo)致的代謝障礙疾病,該疾病至少可分為16 種類型[5]。 GSD0a型和GSD0b 型分別由GYS2 和GYS1 突變導(dǎo)致;GYS1 突變表現(xiàn)為運動疲勞、運動不耐受、累及心臟可引起肥厚性心肌癥,突發(fā)心臟驟停;GYS2 突變表現(xiàn)為餐后高血糖和高脂血癥,伴有肝腫大癥狀[4,18-20]。 肌肉和肝是葡萄糖攝取和轉(zhuǎn)化的主要部位[21],因此,多種類型的糖原貯積癥都累及肌肉、心臟和肝[22-24]。 糖原貯積癥疾病的類型很多,其中以GSD Ⅴ型最為常見,其疾病動物模型類型也較多,包括了天然突變的牛、羊動物模型和人工構(gòu)建的小鼠和斑馬魚模型[25-26]。 目前,GSD0 型疾病的臨床病例報道很少,其疾病模型也只有小鼠模型。Pederson 等[1]構(gòu)建的Gys1 敲除小鼠模型顯示,90%的小鼠出生后死于心功能受損。 Xirouchaki 等[11]構(gòu)建的肌肉特異性Gys1 敲除小鼠顯示,小鼠糖代謝和運動能力受損。 Irimia 等[12]構(gòu)建的肝特異性Gys2基因敲除小鼠模型很好地模擬了GSD0a 病理生理學(xué)。

與小鼠和人類基因結(jié)構(gòu)一樣,斑馬魚gys1 和gys2 基因也包含16 個外顯子,且編碼蛋白的氨基酸序列一致性分別是92%和89%,因此,斑馬魚gys1和gys2 突變體可能很好得模擬人類GYS1 和GYS2基因突變導(dǎo)致的疾病,為進(jìn)一步研究GSD0 型疾病的發(fā)病進(jìn)程及詳細(xì)機(jī)制提供材料。 斑馬魚gys1-/-和gys2-/-突變體的表型與人類患者和小鼠模型表型相似,但也存在差異。 基因組織表達(dá)分析顯示,gys1 和gys2 基因廣泛表達(dá)于所檢測的組織中,但gys1 在肌肉組織中表達(dá)最高,gys2 在肝中表達(dá)最高;這與人類糖原合酶組織表達(dá)模式一致。 糖原染色分析結(jié)果進(jìn)一步顯示,斑馬魚gys1-/-突變體心臟和肌肉組織糖原累積明顯減少,而gys2-/-突變體出現(xiàn)肝組織糖原累積量顯著降低,斑馬魚表型與GSD0 型疾病患者肌肉活檢結(jié)果相一致。 因此,我們構(gòu)建的斑馬魚疾病模型能夠很好模擬人類糖原貯積癥GSD0 型。

與Gys1 敲除小鼠模型F2大部分死亡不同[9],斑馬魚gys1-/-突變體F2正常生長發(fā)育,但其自交后代即F3胚胎發(fā)育缺陷,48 hpf 內(nèi)全部死亡。 對gys1-/-F324 hpf 內(nèi)胚胎發(fā)育過程觀察發(fā)現(xiàn),相對野生型斑馬魚,gys1-/-F3胚胎發(fā)育遲緩(圖4c)。 對gys2-/-突變體的觀察顯示,未發(fā)現(xiàn)異常死亡現(xiàn)象。gys2 是肝糖原合成酶,組織qPCR 結(jié)果也顯示,gys2在肝中顯著高表達(dá);因此,gys2 缺失會導(dǎo)致肝糖原累積降低,但是心臟和肌肉中糖原無明顯變化。 解剖gys2-/-突變體時,發(fā)現(xiàn)突變體肝要比野生型肝體積要小(未做統(tǒng)計分析)。gys2-/-突變體后代能夠正常生長發(fā)育和繁殖。 基因表達(dá)模式分析結(jié)果顯示,gys1 和gys2 在胚胎發(fā)育過程中(1 細(xì)胞期至盾形期)高表達(dá),兩基因都在1 細(xì)胞期的表達(dá)量最高,且gys1 表達(dá)量高于gys2 表達(dá)量。 因此,我們推測gys(糖原)對胚胎早期發(fā)育極為重要,可能為胚胎發(fā)育提供能量。 斑馬魚卵子受精后,胚胎在早期發(fā)育過程中所需要的能量都來源于卵子形成過程中積累的能量。 組織qPCR 結(jié)果顯示,gys1 在整個機(jī)體各個組織都有表達(dá),尤其在肌肉中高表達(dá),同時在卵巢中也有明顯表達(dá),可能對卵子糖原的積累非常重要。 當(dāng)在斑馬魚中敲除gys1,gys1-/-的斑馬魚卵巢可能不能有效的合成糖原,卵子不能有效的積累糖原;因此gys1-/-雌魚產(chǎn)的卵,受精后,早期胚胎沒有足夠的糖原為其發(fā)育提供能量,所以胚胎在發(fā)育過程中死亡,且大多集中在13~14 hpf(圖4a)。 對小鼠的研究表明,小鼠1 細(xì)胞期可以檢測到高的糖原合酶活性,2 細(xì)胞期開始大量積累糖原,胚胎早期發(fā)育階段多種器官的糖原水平先升高后降低;胚胎發(fā)育過程中糖原水平的變化表明,糖原對胚胎發(fā)育可能具有特殊的作用,但很少有研究提供確切證據(jù)[1]。 因此,我們推測gys1 完全缺失,導(dǎo)致gys1-/-F2卵子形成過程中只有少量糖原積累(gys2 可能發(fā)揮作用),不能為受精卵早期發(fā)育持續(xù)提供能量,導(dǎo)致胚胎死亡。

gys1-/-純合子中g(shù)ys2 是否存在顯著代償作用?從組織和早期發(fā)育階段qPCR 結(jié)果來看,gys1 和gys2 的表達(dá)位置具有重合現(xiàn)象,提示基因表達(dá)可能有冗余現(xiàn)象。 但是從突變體的組織切片(圖6c)來看,gys1 不能補(bǔ)償gys2-/-純合子肝表型;同樣,gys2也不能補(bǔ)償gys1-/-純合子心臟和肌肉表型,因此,我們推測gys1-/-純合子中g(shù)ys2 可能不存在顯著代償作用。

斑馬魚gys1-/-F2和gys2-/-純合子能夠正常生長發(fā)育,后續(xù),我們將通過運動耐受、糖耐受和胰島素耐受等實驗,在細(xì)胞和分子水平上闡明GSD0 發(fā)病進(jìn)程和機(jī)制,為深入認(rèn)識人類糖原貯積癥GSD0奠定基礎(chǔ)。