陳嬙，羅東，彭林鳳，陳開森

（南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院1.檢驗(yàn)科；2.呼吸科，江西 南昌 330006）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus, S.aureus, 簡稱金葡菌） 是一種廣泛存在于環(huán)境中的重要病原菌[1,2]，其能量的利用主要是有氧呼吸。 有氧呼吸的本質(zhì)是通過一系列的氧化還原反應(yīng)，最后將電子傳遞給氧生成水，同時偶聯(lián)氧化磷酸化作用生成能量物質(zhì)ATP、ADP 等[3]。NADH、NAD+等在呼吸鏈傳遞能量中具有重要作用。

金葡菌編碼兩個末端氧化酶,分別為cydAB 和qoxABCD 編碼的細(xì)胞色素bd 氧化酶和細(xì)胞色素aa3 氧化酶[4]。 在金葡菌中，cydAB 與qoxABCD 一起失活會阻止呼吸作用并誘導(dǎo)小菌落變體（Smallcolony variants, SCVs）形成[5]，表現(xiàn)為生長代謝緩慢、菌落細(xì)?。ㄕ＞甑?/10 左右）、色素合成能力低下、溶血性下降、凝固酶反應(yīng)遲緩、毒力基因表達(dá)下調(diào),與生物膜形成和黏附相關(guān)的主要基因常常表達(dá)增加[6]。 我們前期的研究證實(shí)了金葡菌cydA基因缺失后,該變異菌不能形成血漿凝固酶,同時毒力因子表達(dá),甚至粘附能力都受到影響[7]。 有研究結(jié)果證實(shí)在結(jié)核分枝桿菌中，cydAB 是與抑制細(xì)菌終末端呼吸氧化酶相關(guān)藥物的潛在靶標(biāo)[8]。

為了更進(jìn)一步了解cydA 如何影響到金葡菌血漿凝固酶形成，我們通過構(gòu)建cydA 突變株，觀察不同外界環(huán)境下cydA 對能量代謝的影響，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒 金黃色葡萄球菌Newman 菌株及溫度敏感型穿梭質(zhì)粒pKOR1，為本實(shí)驗(yàn)室所保存。

1.1.2 試劑和儀器 試劑：營養(yǎng)肉湯，比色法NAD+檢測試劑盒、ATP 檢測試劑盒、氯霉素、TSB、脫水四環(huán)素（中國索萊寶生物科技有限公司）;細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒（DP302，中國天根生化科技北京有限公司），2×PFU PCR Master MIX （中國天根生化科技北京有限公司）；BP ClonaseTM2 Enzyme Mix（美國Invitrogen 公司）；質(zhì)粒提取試劑盒（中國Axygen 公司）。

儀器：聚合酶鏈反應(yīng)（PCR） 儀（BioRead 公司）；電轉(zhuǎn)化儀（BioRead 公司）；紫外凝集成像儀（北京六一公司）；酶標(biāo)儀（山東恒美電子科技有限公司）。

1.2 CydA 敲除株的構(gòu)建 通過融合PCR 將cydA基因上、下游同源片段連接起來；通過基于位點(diǎn)特異性重組的gateway 克隆技術(shù)將融合PCR 產(chǎn)物連接入溫度敏感型穿梭質(zhì)粒pKOR1，轉(zhuǎn)化修飾缺陷型大腸桿菌DC10B，獲得同源重組質(zhì)粒pKOR1-cydA；電轉(zhuǎn)化金黃色葡萄球菌Newman 株；在40℃高溫和10 μg/ml 氯霉素雙重選擇壓力下，質(zhì)粒通過第1 次同源重組整合到金黃色葡萄球菌染色體上；轉(zhuǎn)移到無抗生素的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，發(fā)生第2 次同源重組； 將菌液涂布于含1μg/ml 脫水四環(huán)素的培養(yǎng)基上進(jìn)行反向篩選，最后，挑取菌落通過PCR 鑒定。 本研究所使用的PCR 引物及內(nèi)切酶見表1。

表1 本研究所使用的引物

1.3 不同條件下的細(xì)菌培養(yǎng) 將劃線純化的Newman 野生菌、△cydA 接種至3ml 新鮮肉湯培養(yǎng)基中，37℃，200r/min 過夜培養(yǎng)，第2d，1: 100 比例稀釋后轉(zhuǎn)接到3ml 新鮮LB 培養(yǎng)基中，分別置于常規(guī)氣體及25℃、35℃、40℃條件下恒溫?fù)u床，200r/min過夜培養(yǎng)；此外，將Newman 野生菌、△cydA 放在6%CO2氣體及35℃培養(yǎng)，具體條件參照常規(guī)氣體培養(yǎng)。

1.4 細(xì)菌ATP 的提取及測定 本實(shí)驗(yàn)參照索萊寶ATP 檢測試劑盒的說明書，并做適量修改，具體操作步驟如下：取600nm 下OD 值為1.0 麥?zhǔn)蠁挝坏倪^夜培養(yǎng)菌液1ml，10000g，4℃離心2min 收集到離心管內(nèi)，棄上清；用無菌PBS 緩沖液重懸洗滌3次，去上清液，加入1.0ml 提取液，超聲波破碎6 min（超聲條件：冰浴，強(qiáng)度20%，超聲2s，停1s，10,000g，4℃離心10min；取上清液至另一EP 管中，加入500μl 的氯仿充分震蕩混勻，10,000g 4℃離心3min，取上清液于1.5m LEP 管中，置冰上待測；酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min 以上，調(diào)節(jié)波長到340nm，蒸餾水調(diào)零； 臨用前按ATP 試劑盒內(nèi)說明書，配制工作液，冰上避光操作；按順序在96 孔板中依次加入樣本液20μl，檢測工作液100μl，迅速吹打混勻后，立即速置于酶標(biāo)儀中測定340nm 下10s 的吸光值A(chǔ)1；然后將96 孔板放入37℃培養(yǎng)箱中孵育3min，速置于酶標(biāo)儀中測定吸光度值A(chǔ)2。 分別計(jì)算ΔA測定=A2 測定管-A1 測定管，并記錄結(jié)果。 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中ATP 的濃度。

1.5 NAD+ 的提取及測定 本實(shí)驗(yàn)參照索萊寶NAD+檢測試劑盒的說明書，并做適量修改，具體操作步驟如下：取600nm 下OD 值為1.0 麥?zhǔn)蠁挝坏倪^夜培養(yǎng)菌液1ml，10,000g，4℃離心2min 收集到1.5ml EP 離心管內(nèi)，棄上清；用無菌PBS 緩沖液重懸洗滌3 次，去上清液，加入1ml 酸性提取液，超聲波破碎6min（超聲條件：冰浴，強(qiáng)度20%，超聲2s，停1s），10000g，4℃離心10min；煮沸5min，冰浴中冷卻后，10000g 4℃離心10min； 取上清液200 μL 轉(zhuǎn)移至另一新的1.5ml EP 管中，加入等量堿性提取液使之中和，10000g 4℃離心10min，取上清液，冰上保存待測；酶標(biāo)儀調(diào)節(jié)波長至570nm，蒸餾水調(diào)零；取1.5ml 棕色EP 管分別設(shè)定對照管，測定管，空白管，加入上清液，及蒸餾水；向?qū)φ展芗尤爰尤隢AD 試劑盒內(nèi)標(biāo)注的NAD+反應(yīng)液，充分混勻，室溫避光靜置20min；向測定管，空白管中加入NAD+反應(yīng)液100μl，充分混勻，靜置5min 后，15,000rpm，25℃離心15min，棄上清，沉淀中加入NADH 檢測液200μl。 立即吹打混勻，取200μl 至96 孔板中，迅速將96 孔板置入酶標(biāo)儀，設(shè)置37℃孵育2h，570nm 下比色； 讀取吸光值△A=A 測定管-A 對照管，空白管做一到兩次，記錄吸收值。 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中NAD+的濃度。

1.6 生長曲線實(shí)驗(yàn) 將Newman 野生菌、cydA 敲除株接種至3 mL 新鮮肉湯培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)，隨后將細(xì)菌以1：50 稀釋至新鮮TSB 培養(yǎng)基中，于37℃100 rpm 搖床震蕩培養(yǎng)，大約每隔1h 取100 μl 細(xì)菌測OD600，測定完畢后用Graphpad prism5繪制細(xì)菌生長曲線，獨(dú)立重復(fù)至少三次。

2 結(jié)果

2.1 CydA 敲除株構(gòu)建成功的驗(yàn)證 采用cydA 基因上下游引物篩選cydA 敲除菌落，結(jié)果如圖1，圖中的第1、2、4、9 泳道為野生Newman 菌株，含有cydA 基因片 段，擴(kuò)增 出3039bp 的條帶，其中3，5，6，7，8 泳道為初篩基因敲除成功株，無cydA基因片段，擴(kuò)增出1250bp 條帶，并對圖中的陽性克隆PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測序，與Newman 標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對，證實(shí)cydA 基因均被成功敲除。

圖1 CydA 基因上下游引物PCR 擴(kuò)增篩選結(jié)果

2.2 CydA 基因缺陷對ATP 檢測結(jié)果的影響 為了研究cydA 基因缺陷是否會影響金黃色葡萄球菌的能量代謝，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中ATP 濃度。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)在不同培養(yǎng)條件時，cydA 基因缺陷型株中的ATP 的水平相比Newman 菌株均無顯著降低（P>0.05），表明cydA 基因失活后不會使金葡菌胞內(nèi)能量物質(zhì)ATP 減少進(jìn)而影響細(xì)菌生長繁殖，見圖2。

圖2 常規(guī)氣體條件下Newman 菌內(nèi)ATP 水平

2.3 CydA 基因缺陷對NAD+ 檢測結(jié)果的影響NAD+是細(xì)胞中含量最豐富的輔酶，NADH 為它的還原形式。 在呼吸作用中，在糖酵解、三羧酸循環(huán)過程中由NAD+產(chǎn)生NADH，而在氧化磷酸化過程中，NADH 釋放出質(zhì)子和電子，提供能量合成ATP，因此，如果細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)NAD+減少，會直接抑制呼吸作用，進(jìn)而抑制氧化磷酸化產(chǎn)生ATP。 為了驗(yàn)證CydA 基因缺陷會導(dǎo)致金黃色葡萄球菌胞內(nèi)NAD+水平降低，從而影響ATP 的合成，根據(jù)NAD+標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中NAD+的濃度。 檢測了不同菌株中NAD+的水平。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在不同溫度條件和不同CO2濃度水平下，cydA 基因缺陷型菌株中的NAD+的水平相比Newman 野生株均有顯著降低，見圖3、圖4 和圖5。

圖3 6%CO2 氣體條件下Newman 菌內(nèi)NAD+ 水平

圖4 . 常規(guī)氣體條件下Newman 菌內(nèi)NAD+ 水平（*, P＜0.05; **, P＜0.01）

圖5 6% CO2 氣體條件下Newman 菌內(nèi)NAD+ 水平（*, P＜0.05; **,P＜0.01）

3.4 CydA 基因?qū)?xì)菌生長的影響 在12h 的生長時間內(nèi)，cydA 基因敲除株的生長并未出現(xiàn)顯著影響（P＞0.05）；表明cydA 基因的缺失并不會影響細(xì)菌的生長，見圖6。

圖6 細(xì)菌生長曲線

3 討論

CydA 是bd 型細(xì)菌泛醌細(xì)胞色素氧化酶的一個亞基，目前對于bd 型細(xì)菌泛醌細(xì)胞色素氧化酶的認(rèn)識主要來自大腸埃希菌，bd 型的泛醌細(xì)胞色素氧化酶是膜上的呼吸鏈末端氧化酶，參與NADH分解代謝并為ATP 的合成提供質(zhì)子跨膜運(yùn)動的動力[9]。 本研究以cydA 基因缺陷型菌株為切入點(diǎn)，通過檢測金葡菌胞內(nèi)NAD+和細(xì)菌胞內(nèi)ATP 水平，發(fā)現(xiàn)金葡菌cydA 缺陷株內(nèi)ATP 水平無明顯變化，但NAD+水平明顯下降，由于△cydA 中只有aa3型末端氧化酶存在，這一結(jié)果產(chǎn)生可能是由于細(xì)胞內(nèi)aa3 型末端氧化酶電子傳遞鏈分支產(chǎn)能效率稍低[8]，產(chǎn)生了較少的NADH，從而使NAD+含量下降，此外，cydA 失活后，可能存在其他產(chǎn)能途徑補(bǔ)償了金黃色葡萄球菌內(nèi)ATP 合成，這從cydA 基因缺失后，生長能力未改變一致。

本研究發(fā)現(xiàn)金葡菌cydA 基因突變可以影響NAD+的生成，從而導(dǎo)致血漿凝固酶等毒力因子的形成能力降低，這一發(fā)現(xiàn)具有一定應(yīng)用價值，表現(xiàn)為抗金葡菌毒素雖然不能直接殺死金葡菌，但可以降低其防御能力，有利于免疫細(xì)胞殺傷及抗生素的有效殺滅[10]。 同時我們通過基因序列比對發(fā)現(xiàn)該基因序列較為保守，是否存在其它菌該基因缺失也導(dǎo)致毒力降低值得探討。 由于抗生素的副作用越來越明顯地影響到細(xì)菌的防治，故通過影響病原體毒力因子的表達(dá)也許是一種新的思路，故該基因作為新的抗菌靶點(diǎn)值得期待。