王敏君，劉清桂，陳 費

(海軍軍醫(yī)大學基礎醫(yī)學院細胞生物學教研室， 上海 200433； △通訊作者)

醫(yī)學細胞生物學是通過研究細胞結構、功能和生命活動，將細胞生物學的理論知識和研究技術引入各種醫(yī)學問題探討一門學科，是醫(yī)學、生物學課程中重要的基礎課程[1]。其實驗課程與理論課程相輔相成，實驗課程的主要目的不僅是輔助學生對理論知識的深入理解，更是希望能夠培養(yǎng)學生分析、解決問題的能力、科研創(chuàng)新能力以及對科學研究的興趣和熱情，在醫(yī)學細胞生物學的整個教學環(huán)節(jié)起著舉足輕重的作用[2,3]。細胞骨架是真核細胞中的蛋白纖維網(wǎng)絡系統(tǒng)，與細胞的形態(tài)功能、生命活動密切相關，是醫(yī)學細胞生物學理論課程的重點內容。通過對細胞骨架的觀察，學生能夠加深對細胞骨架理論概念的理解，也有助于認識細胞生命活動的現(xiàn)象。

微絲是普遍存在于真核細胞中由肌動蛋白組成的骨架纖維，可成束、網(wǎng)狀或散在分布于細胞質中，對構成細胞支架和維持細胞形態(tài)的功能有著重要的作用。由微絲形成的微絲束又稱為應力纖維，是一種較穩(wěn)定的結構，多與細胞的長軸平行，貫穿細胞的全長。微絲伴隨著細胞形態(tài)的變化和生命活動不斷地發(fā)生組裝和去組裝的過程，而此過程中常受到一些藥物的影響從而影響細胞功能的正常執(zhí)行，進而導致相關疾病的發(fā)生。細胞松弛素B(Cytochalasin B)主要破壞微絲的組裝，并破壞細胞的形態(tài)結構以及細胞移動、分裂等生命活動。而去除細胞松弛素B后，微絲的結構和功能又可恢復。

細胞內微絲束的觀察是生物醫(yī)學本科層次開設的實驗必修項目之一?，F(xiàn)有的醫(yī)學細胞生物學實驗教程只關注于微絲染色的實驗本身，并未將其與實驗教學的理論目的結合，教學效果不明顯。而傳統(tǒng)的實驗教學多選用單一的考馬斯亮藍染色標記微絲束，該染色方法為非特異蛋白染色，不能特異性區(qū)別細胞骨架組成。為此，近年來隨著熒光顯微鏡在本科教學實驗室的普及，我們從微絲功能角度、藥物作用對細胞影響原理等角度出發(fā)對該實驗課程進行了以下改進和優(yōu)化，取得了較為滿意的實驗效果。

1 實驗課程設計內容優(yōu)化

1.1 課程設計目標要求

我們以理解微絲功能-構成細胞的支架并維持細胞的形態(tài)為課程目標。學生體外培養(yǎng)細胞用細胞松弛素B處理不同時間后再逐步恢復，結合不同染色方法觀察各個狀態(tài)下細胞內微絲分布掌握微絲作為細胞骨架成分的重要功能。

1.2 課程設計內容

成纖維細胞是微絲束觀察較好的細胞材料，細胞內微絲是由肌動蛋白組成，通過肌動蛋白的顯色而觀察細胞內微絲的分布?？捡R斯亮藍染色原理是其能夠與蛋白質結合，檢測出細胞內的蛋白質，光學顯微鏡下即可觀察到細胞內蛋白質的分布情況，是檢測細胞內微絲束較為常用的方法。而鬼筆環(huán)肽只與聚合的微絲有強親和作用，而不與肌動蛋白單體分子結合，更加明確了細胞內微絲束的分布狀態(tài)。我們在教學實驗過程中采用特異性熒光染料Alexa Fluor?88鬼筆環(huán)肽來直接標記染色，并在熒光顯微鏡下觀察微絲束。兩種染色方法結合光學和熒光顯微鏡觀察可幫助學生更好地分辨細胞內微絲分布。

為更加突顯微絲在細胞支撐骨架和形態(tài)維持中的重要作用，體外培養(yǎng)細胞分別進行不同時間的細胞松弛素B處理以及撤去細胞松弛素B后再培養(yǎng)，以觀察各組成纖維細胞的形態(tài)和微絲束的分布，分析比較微絲在細胞中的形態(tài)特征以及其與細胞形態(tài)結構的相關性。

2 實驗課程實施方案優(yōu)化

2.1 實驗材料準備

兩位學生為一組。實驗教師為每一組準備3個6孔板的細胞。第一板6孔板接種6孔成纖維細胞，實驗教師待細胞生長密度為60%后進行處理。其中兩個孔為不做任何處理的成纖維細胞，兩個孔為細胞松弛素B處理半小時的成纖維細胞(即在細胞培養(yǎng)液中加入終濃度為10 μM細胞松弛素B)，兩個孔為細胞松弛素B處理半小時后PBS清洗3遍添加新培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 h的成纖維細胞。第二板6孔板接種3孔成纖維細胞，實驗人員待細胞生長密度達60%后，更換帶有細胞松弛素B的培養(yǎng)基。其中第一孔為原培養(yǎng)基，第2和3孔為含有細胞松弛素B的培養(yǎng)基，第2孔培養(yǎng)10 min，第3孔培養(yǎng)30 min。第三板6孔板接種4孔成纖維細胞，實驗教師待細胞生長密度達60%后，全部更換帶有細胞松弛素B的培養(yǎng)基培養(yǎng)30 min。隨后，實驗教師再更換為無細胞松弛素B的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)0，0.5，1和2 h。所有處理組細胞由實驗教師計算好時間并在學生實驗開始前準備好，到處理時間后將細胞板從培養(yǎng)箱取出，封閉容器以最大限度降低細胞生命活動。除第一個6孔板外，對于其余兩個6孔板，實驗教師處理好后細胞棄培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，滴加1%多聚甲醛預固定。

為節(jié)約上課時間，實驗用所有試劑由實驗教師提前準備好。主要試劑為：PBS緩沖液、1%TritonX-100、M-緩沖液、3%戊二醛溶液、4%多聚甲醛、0.2%考馬斯亮藍R250染液、2 μg/ml Alexa Fluor?488鬼筆環(huán)肽、2 μg/ml DAPI。細胞松弛素B粉末溶解于DMSO試劑，儲存濃度為10 mM。

2.2 實驗實施過程

2.2.1 細胞通透及固定 第一個6孔板由一位學生進行。學生棄掉6孔板內培養(yǎng)基，更換PBS洗滌3次；其中3個孔加入1%TritonX-100液，置于37 ℃恒溫箱中處理15-20 min，以去掉細胞骨架以外的部分蛋白質。立即用M-緩沖液輕輕洗滌3次，每次3 min，使細胞骨架穩(wěn)定；然后再加入3%戊二醛溶液繼續(xù)固定10 min，固定后PBS清洗3次，后續(xù)采用考馬斯亮藍染色；另3個孔細胞滴加4%多聚甲醛固定5 min，PBS清洗3遍，后續(xù)采用熒光染色。學生應合理安排實驗時間，可等待TritonX-100處理結束后再進行另三組成纖維細胞的多聚甲醛固定。

另兩個6孔板由第二位學生進行。學生在固定之前先在倒置顯微鏡下進行拍照，記錄不同處理組細胞的形態(tài)；隨后，棄孔板中原有1%多聚甲醛溶液，滴加1 ml 4%多聚甲醛固定5 min，PBS清洗3遍，再進行熒光染色。

2.2.2 染色與觀察 考馬斯亮藍染色組中，學生加入0.2%考馬斯亮藍R250染液染色30 min，然后自然水清洗數(shù)次，再滴加少量PBS后置于普通倒置顯微鏡下觀察。熒光染色組中，學生加入2 μg/ml Alexa Fluor?488鬼筆環(huán)肽，室溫染色30-60 min，PBS清洗3次后，滴加2 μg/ml DAPI染液，然后置于熒光倒置顯微鏡下觀察。

3 實驗結果分析

3.1 實驗結果顯示

普通光學顯微鏡下，學生觀察到無細胞松弛素B處理和細胞松弛素B處理30 min后再撤去繼續(xù)培養(yǎng)2 h的小鼠成纖維細胞內藍色的微絲貫穿細胞軸，細胞核染色為深藍色。而細胞松弛素B處理組細胞內除深藍色細胞核外，無明顯的淺藍色絲狀結構。鬼筆環(huán)肽熒光染料染色后，熒光顯微鏡觀察到對照組和恢復組的小鼠成纖維細胞內明顯的綠色微絲束結構，粗而密集的微絲組成的應力纖維成束分布在細胞質中，而細胞松弛素處理組細胞內未見明顯的綠色熒光束。這兩種染色方法都清晰地觀察到細胞內微絲束的分布。

其次，倒置顯微鏡下觀察到未進行細胞松弛素處理的成纖維細胞鋪展好，細胞形態(tài)舒展，細胞胞體較大呈多邊形，細胞有突起。而隨著細胞松弛素B處理時間的延長(分別處理0，10，30 min)，細胞鋪展逐漸縮小，突起變少。鬼筆環(huán)肽熒光染色下，學生也同樣觀察到細胞松弛素B處理10 min后，伴隨著細胞邊圓，細胞內微絲束明顯收縮變短。在細胞松弛素處理30 min后，細胞內微絲束消失，細胞進一步變圓，細胞間間隙擴大，細胞突起減少。結果說明細胞松弛素B可有效抑制微絲的組裝聚集，而微絲的去組裝則極大地影響了細胞形態(tài)維持。

而培養(yǎng)的成纖維細胞去除細胞松弛素B后，結果顯示，伴隨著正常培養(yǎng)基下成纖維細胞培養(yǎng)時間的延長(分別恢復0.5，1和2 h)，細胞形態(tài)逐漸恢復，細胞重新鋪展，突起變多。同樣，撤去細胞松弛素B 2 h后，鬼筆環(huán)肽熒光染色顯示細胞內微絲束呈平行排列，沿著細胞軸分布。

3.2 微絲束分布現(xiàn)象分析

考馬斯亮藍和鬼筆環(huán)肽熒光染料都可以清晰地觀察到細胞內微絲束的分布，但是鬼筆環(huán)肽熒光染色實驗過程相對簡單，培養(yǎng)板底部貼壁細胞也不會因Triton X-100的作用而脫落，增加了實驗的成功率和可操作性。細胞松弛素B可有效地抑制細胞內微絲的組裝聚集，在細胞松弛素B處理的細胞中，由于微絲逐漸被破壞而不能夠支撐細胞以及維持細胞形態(tài)，使得細胞失去突起、不能鋪展而形狀變圓。而去除細胞松弛素B后，肌動蛋白重新聚合形成微絲，細胞內微絲組成的應力纖維結構逐漸恢復，從而導致細胞形態(tài)再次恢復正常，微絲應力纖維也沿著細胞軸分布。

4 課程優(yōu)化的教學效果

微絲功能-構成細胞的支架并維持細胞的形態(tài)實驗課程設計的結果：100%的學生充分理解了微絲作為細胞結構支架的功能體現(xiàn)，理解實驗原理，掌握了染色技術；90%以上的學生實驗結果良好，兩種染色方法都觀察到微絲的分布與定位。傳統(tǒng)的考馬斯亮藍染色原理是針對蛋白質的染色，并不能特異地顯示微絲的分布，而且Triton X-100處理也有可能不是完全將非細胞骨架蛋白破壞掉，會影響實驗結果顯示。我們增加直接熒光鬼筆環(huán)肽染色能夠特異性地顯示微絲在細胞內的分布，有助于學生對微絲結構的理解和掌握。其次，我們通過設計細胞松弛素B藥物處理的不同時間以及去細胞松弛素B藥物繼續(xù)培養(yǎng)不同時間，結合倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)和熒光纖維化下對微絲的分布，更好地幫助學生理解微絲在細胞形態(tài)維持中的重要作用。

細胞骨架的觀察是醫(yī)學細胞生物學實驗課程中一個經(jīng)典且重要的實驗。實驗課程的優(yōu)化，不僅加深學生對細胞骨架中微絲的認識，也提高了學生的學習興趣以及其對科研探索的積極性[4]。