周艷萌，劉 霜，李 瀅，馮正軍，向文安，盧 濤，宋 鴻

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 遵義 563000；2.遵義醫(yī)科大學(xué)，貴州 遵義 563000；3.遵義醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染科，貴州 遵義 563000；4.遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院內(nèi)科，貴州 遵義 563000；5.遵義市正安縣中醫(yī)院口腔科，貴州 遵義 563000；6.遵義市婦幼保健院藥劑科，貴州 遵義 563000)

乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)感染引起的疾病，全球HBV慢性感染者超過2.4億人。據(jù)估計(jì)，每年有超過88.7萬人死于嚴(yán)重的肝病，包括肝硬化和肝細(xì)胞癌(HCC)。HBV感染引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)可能通過炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激介導(dǎo)的DNA損傷和肝細(xì)胞增殖等途徑參與慢性炎癥的肝臟癌變和疾病進(jìn)展[1]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)蛋白合成后修飾、折疊的重要場(chǎng)所。在病理?xiàng)l件下，如突變蛋白的過表達(dá)和(或)分泌蛋白合成的過負(fù)荷，未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)積聚，這被稱為ERS[2]；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的監(jiān)測(cè)則是由未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)介導(dǎo)的，UPR是一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，可感知內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管腔中蛋白質(zhì)折疊的保真度[3]。許多研究報(bào)道，在HBV感染的細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中存在大量病毒蛋白，這些超載的蛋白導(dǎo)致了ERS，進(jìn)而導(dǎo)致肝硬化、HCC等嚴(yán)重肝病的進(jìn)展[4-7]，ERS在重型肝炎肝衰竭發(fā)病的過程中起到重要又復(fù)雜的作用，但是由于取肝臟組織危險(xiǎn)系數(shù)高且不易被患者接受，因此具體機(jī)制的研究受到一定限制。HBV是一種泛嗜性病毒，最近研究發(fā)現(xiàn)，HBV可感染外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)并在其中復(fù)制，在PBMCs 中檢測(cè)到了病毒RNA轉(zhuǎn)錄的模板ccc HBV DNA，所有的PBMCs均有HBV RNA[8-10]。CHB患者PBMCs中的ERS與其疾病進(jìn)程的關(guān)系尚鮮見報(bào)道。本研究通過收集的輕、中、重度CHB患者的PBMCs，檢測(cè)PBMCs中ERS蛋白GRP78、GRP94及CHOP的變化，并分析其與CHB患者病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性，為臨床預(yù)測(cè)CHB患者病情的發(fā)展提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1檢測(cè)對(duì)象 以2016—2017年就診于遵義醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院、遵義市婦幼保健院、遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院、遵義市正安縣人民醫(yī)院及中醫(yī)院的CHB患者為研究對(duì)象，所有CHB患者依據(jù)《慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)》[11]進(jìn)行診斷和分度，共分別收集到30例輕度、25例中度及25例重度CHB患者外周血，同時(shí)收集35例健康體檢者外周血。所有CHB患者的甲型肝炎病毒(HAV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)、戊型肝炎病毒(HEV)、巨細(xì)胞病毒(CMV)、人類免疫缺陷病毒(HIV)抗體均陰性，采集標(biāo)本均在患者知情情況下進(jìn)行，同時(shí)簽署了知情同意書并獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)材料 淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自四海生物公司，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增試劑盒和熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司，BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司，SDS-PAG凝膠試劑盒和β-actin一抗購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，GRP78一抗、GRP94一抗及CHOP一抗購(gòu)自美國(guó)abcam公司，山羊抗小鼠二抗購(gòu)自美國(guó)proteintech公司。PCR擴(kuò)增儀、熒光定量PCR儀、全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)、SDS-PAGE電泳系統(tǒng)和SDS-PAGE電轉(zhuǎn)系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司，低溫高速離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)Beckman Coullter公司。

1.2方法

1.2.1收集三組患者基線特征資料 包括患者性別、年齡、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總膽紅素(TBIL)、清蛋白(ALB)、凝血酶原活動(dòng)度(PTA)。

1.2.2淋巴細(xì)胞收集 采用密度梯度離心法收集三組患者的PBMCs。

1.2.3PBMCs中ERS蛋白的核酸表達(dá)水平檢測(cè) 根據(jù)TRNzol總RNA提取試劑盒的步驟提取分離的PBMCs中總RNA，然后按照PrimeScriptTMRT reagent Kit的操作將所提RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，最后根據(jù)SYBR?Fast qPCR Mix試劑盒的操作進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，反應(yīng)條件：95 ℃、30 s；之后95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，39個(gè)循環(huán)，最后65 ℃、5s。通過公式計(jì)算基因相對(duì)定量2-ΔΔCt：相對(duì)定量=目的基因的表達(dá)量/內(nèi)參基因的表達(dá)量×100。引物序列見表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR中的引物序列

1.2.4PBMCs中ERS蛋白的蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 采用western-blotting檢測(cè)GRP78、GRP94、CHOP在蛋白水平的表達(dá)量。將細(xì)胞裂解液加入分離的PBMCs中，以15 300 r/min、4 ℃離心5 min測(cè)定蛋白濃度，根據(jù)BCA結(jié)果加入蛋白上樣緩沖液，煮沸7 min使蛋白變性；取變性蛋白上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜，加入1∶1000稀釋的一抗，4 ℃冰箱過夜，TBST洗滌5次，用1∶3 000稀釋的二抗，室溫、搖床孵育1 h，TBST洗滌5次，ECL顯色液A、B按1∶1體積比例混合，均勻覆蓋于膜上，避光室溫作用8 min，曝光。結(jié)果采用Quantity One定量分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度測(cè)定。

2 結(jié) 果

2.1三組CHB患者基線特征 本研究共納入80例CHB患者，輕度CHB患者中男16例，女14例，年齡18～24歲；中度CHB患者中男20例，女5例，年齡41～76歲；重度CHB患者中男21例，女4例，年齡23～66歲。輕度CHB患者的ALT、AST水平升高不明顯，說明肝細(xì)胞損傷不明顯；而中、重度CHB患者ALT、AST水平顯著升高，說明肝細(xì)胞損傷嚴(yán)重，見表2。

表2 三組CHB患者基線特征比較

2.2各組ERS蛋白的核酸表達(dá)水平比較 健康對(duì)照組及CHB輕、中、重度組GRP78、GRP94組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；且隨CHB患者病情的加重，GRP78、GRP94、CHOP的表達(dá)水平明顯升高，CHB輕度組CHOP表達(dá)水平與健康對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 CHB患者ERS蛋白的核酸表達(dá)水平比較

2.3CHB患者ERS蛋白的蛋白表達(dá)水平比較 western-blotting結(jié)果與qRT-PCR結(jié)果趨勢(shì)一致，CHB輕度組CHOP表達(dá)水平與健康對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，健康對(duì)照組及CHB患者輕、中、重度組GRP78、GRP94組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且隨CHB患者病情的加重，GRP78、GRP94、CHOP的表達(dá)水平明顯升高，見圖1、表4。

表4 各組ERS蛋白的蛋白表達(dá)水平比較

1為健康對(duì)照組；2為輕度CHB組；3為中度CHB組；4為重度CHB組。

2.4ERS蛋白的核酸、蛋白表達(dá)水平與ALT、AST相關(guān)性分析 ERS蛋白GRP78、GRP94 和CHOP的核酸、蛋白水平相對(duì)表達(dá)量與CHB患者AST、ALT均呈正相關(guān)(P<0.05)，見圖2、3。

圖2 GRP78、 GRP94、CHOP蛋白的核酸水平相對(duì)表達(dá)量與AST、ALT相關(guān)性分析

圖3 GRP78、 GRP94、CHOP蛋白的蛋白水平相對(duì)表達(dá)量與AST、ALT相關(guān)性分析

3 討 論

HBV感染是一個(gè)全球性的公共衛(wèi)生問題[12]，至少三分之一的肝硬化病例由 CHB發(fā)展而來，而很大比例的CHB患者最終進(jìn)展為HCC[13]。在中國(guó)，大約有1億例HBV感染者和病毒攜帶者，三分之一患有CHB，每年約有50萬人因肝功能衰竭、肝硬化、肝細(xì)胞癌和HBV感染的其他并發(fā)癥而過早死亡[14]。ERS誘導(dǎo)了一個(gè)復(fù)雜的穩(wěn)態(tài)信號(hào)通路，該通路可以維持生理平衡以保護(hù)細(xì)胞免受損傷。然而，長(zhǎng)期的ERS可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，這也是許多疾病發(fā)病的重要因素[12]。當(dāng)病毒感染細(xì)胞時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)容易受病毒復(fù)制和合成的病毒蛋白影響，大量的展開或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)聚集在ER中引起ERS[15]。近幾年研究發(fā)現(xiàn)多種肝臟疾病的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸與ERS有關(guān)系，研究發(fā)現(xiàn)HBV、HCV等可誘導(dǎo)肝細(xì)胞的ERS反應(yīng)，并與病毒復(fù)制、肝細(xì)胞損傷、肝癌的發(fā)生有關(guān)[7,16]。HBV是一個(gè)泛嗜性病毒，除肝細(xì)胞外還可以感染PBMCs和其他組織細(xì)胞。HBV的基因組可以以整合的形式存在于HBsAg陰性HBV患者的PBMCs中。MURAKAMI等[17]首次明確證實(shí)了HBV感染的急性期肝組織和PBMCs中有整合的病毒DNA。HBV-DNA也能在CHB患者血清和PBMCs中持續(xù)存在，整合到PBMC的DNA染色體中，并可在外周血單個(gè)核細(xì)胞中檢測(cè)到HBV轉(zhuǎn)錄[18]。GHARTAVOL等[19]發(fā)現(xiàn)隱匿性HBV感染者的PBMCs標(biāo)本中HBV-DNA陽(yáng)性檢出率高于血漿標(biāo)本，HBV的cccDNA也能在PBMCs中被檢出，在不能檢測(cè)肝臟樣本中HBV-DNA的時(shí)候，血漿和PBMCs中HBV-DNA的檢測(cè)可以提供可靠的信息。作者前期研究也在CHB患者的PBMCs中檢出HBV-DNA，且外周血中HBV-DNA拷貝越高，PBMCs中HBV-DNA陽(yáng)性率越高；同時(shí)也發(fā)現(xiàn)HBV-DNA可引起健康人PBMCs、GRP78、GR94和CHOP表達(dá)的增高[20]；而本研究中發(fā)現(xiàn)CHB患者PBMCs 中GRP78、GR94和CHOP在核酸、蛋白水平的表達(dá)隨病情加重而增高，進(jìn)一步說明HBV可能是引起ERS的因素之一。在ERS的早期，PBMCs中GRP78、GRP94的高表達(dá)提示細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)了ERS且觸發(fā)了UPR[21-23]，本研究CHB患者PBMCs中GRP78、GRP94水平升高可能是為了修復(fù)錯(cuò)誤折疊或未折疊蛋白，從而保護(hù)PBMCs免受損傷。CHOP的高表達(dá)，則提示細(xì)胞凋亡通路被激活[24]，本研究CHB患者PBMCs中CHOP在基因水平和蛋白水平的表達(dá)隨病情加重而升高，輕度組低表達(dá)可能是由于PBMCs中雖然出現(xiàn)了ERS，但是通過UPR減少了蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊，ERS的穩(wěn)態(tài)得到逐步恢復(fù)，此時(shí)凋亡通路尚未被激活。而在中、重度組PBMCs中由于ERS繼續(xù)加劇，大量聚集的錯(cuò)誤折疊或未折疊的蛋白質(zhì)不能得到及時(shí)修正和降解，從而使得凋亡通路被激活，出現(xiàn)CHOP的高表達(dá)。本研究也發(fā)現(xiàn)CHB患者PBMCs中GRP78、GRP94、CHOP與AST、ALT呈正相關(guān)，提示肝臟炎癥程度可能與ERS蛋白的變化存在一定的關(guān)系。

綜上所述，CHB患者PBMCs中的ERS可能與HBV感染和在PBMCs中的增殖有關(guān)，也與HBV病程中產(chǎn)生的炎癥有關(guān)，提示PBMCs中ERS參與了CHB感染后的疾病進(jìn)程，但具體機(jī)制尚不明確。