◎ 馬曉倩，方 玲，袁月蘭，趙成明

（馬鞍山市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，安徽 馬鞍山 243000）

目前蛋白質(zhì)的檢測(cè)方法主要有凱氏定氮法[1]、分光光度法和燃燒法，第一法和第二法適用于各種食品中蛋白質(zhì)的測(cè)量，第三法適用于蛋白質(zhì)含量在10 g/100 g以上的糧食、豆類(lèi)奶粉、米粉、蛋白質(zhì)粉等固體試樣的測(cè)量。其中第一法凱氏定氮法測(cè)食品中的蛋白質(zhì)是仲裁法，檢測(cè)方法更加簡(jiǎn)單，檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。針對(duì)不同食品，蛋白質(zhì)含量有不同要求，當(dāng)檢測(cè)結(jié)果在限量值附近時(shí)，結(jié)果的準(zhǔn)確性具有重要影響，不確定度[2]是檢測(cè)檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性的重要指標(biāo)。本文采用《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》（GB 5009.5—2016）[3]中的第一法凱氏定氮法測(cè)量大豆粉中的蛋白質(zhì)，根據(jù)蛋白質(zhì)的計(jì)算方法建立數(shù)學(xué)模型。以《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》[4]（JJF 1059.1—2012）系統(tǒng)性地分析不確定來(lái)源，為樣品檢測(cè)結(jié)果提供可靠地科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆粉，市鹽；酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液，0.100 0 mol·L-1；氫氧化鈉溶液，400 g·L-1；甲基紅乙醇溶液，1 g·L-1；亞甲基藍(lán)乙醇溶液，1 g·L-1；硼酸溶液，20 g·L-1；水為三級(jí)用水。

1.2 儀器與設(shè)備

Kjeltec 8400 凱氏定氮儀（瑞典，F(xiàn)oss）；Kjeltec 8400 八管消化爐（瑞典，F(xiàn)oss）；ME204E/02 梅特勒-托利多電子天平（分度值0.1 mg，瑞士Mettler TOLEDO公司）。

1.3 測(cè)量方法

稱(chēng)取充分混勻的固體試樣0.5 g于消化管中，精確至0.001 g，再加入10 mL的硫酸溶液、0.4 g硫酸銅和6 g硫酸鉀于消化爐中進(jìn)行消化。當(dāng)消化爐溫度達(dá)到420 ℃之后，繼續(xù)消化1 h，此時(shí)消化管中的液體呈綠色透明狀，取出冷卻至室溫。設(shè)置儀器參數(shù)稀釋液體積為70 mL，堿液體積為50 mL，接收液體積為30 mL，于全自動(dòng)凱氏定氮儀[5]上實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)加液、蒸餾、滴定和記錄滴定數(shù)據(jù)過(guò)程，實(shí)驗(yàn)前需做2次空白實(shí)驗(yàn)，再依次測(cè)量5次樣品。

2 數(shù)學(xué)模型

根據(jù)蛋白質(zhì)的計(jì)算原理，得出蛋白質(zhì)含量計(jì)算公式如下：

式中：X-試樣中蛋白質(zhì)的含量，g/100 g；V-試液消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積，mL；V0-試劑空白消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積，mL；C-鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液濃度，mol·L-1；0.014 0-1.0 mL鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量，g；M-試樣的質(zhì)量，g；5.71-大豆粉中氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)；100-換算系數(shù)。

3 結(jié)果與分析

3.1 不確定度來(lái)源分析

凱氏定氮法測(cè)定大豆粉中蛋白質(zhì)的含量的不確定度的來(lái)源主要是鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制標(biāo)定過(guò)程、氯化銨標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、分析儀器的重復(fù)測(cè)量過(guò)程以及樣品前處理稱(chēng)量過(guò)程等環(huán)節(jié)。

3.2 鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液不確定度分量urel1

3.2.1 鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制和標(biāo)定

根據(jù)GB/T 601—2016[6]標(biāo)準(zhǔn)要求，先用濃鹽酸配制成1 000 mL的0.1 mol·L-1的鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液。重復(fù)滴定6次，計(jì)算得出鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度分別為0.101 34 mol·L-1、0.101 51 mol·L-1、0.101 21 mol·L-1、0.101 32 mol·L-1、0.101 48 mol·L-1和 0.101 37 mol·L-1。鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均濃度為0.101 4 mol·L-1。鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定結(jié)果引入的標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：

3.2.2 標(biāo)定鹽酸的基準(zhǔn)試劑碳酸鈉的純度

按照GB/T 601—2016標(biāo)準(zhǔn)要求，將基準(zhǔn)試劑無(wú)水碳酸鈉于270～300 ℃的高溫爐中烘干至恒重。基準(zhǔn)試劑碳酸鈉的純度為100%±0.05%，視為矩形分布為：

3.2.3 天平稱(chēng)量所引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

干燥器與天平[7]稱(chēng)量?jī)?nèi)均放置相同硅膠，稱(chēng)量時(shí)無(wú)吸潮。本次稱(chēng)量使用的天平是ME204E/02梅特勒-托利多電子天平，天平的量程為0～220 g，分度值為s=0.1 mg，根據(jù)該天平檢定證書(shū)可知，在0～50 g稱(chēng)量范圍內(nèi)，天平的最大允許誤差為0.000 5 g，采用矩形分布計(jì)算稱(chēng)樣量為0.2 g時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.2.4 標(biāo)定體積的不確定度

根據(jù)鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定的體積平均為37.25 mL，滴定使用50 mL酸式滴定管（A級(jí)），根據(jù)常用玻璃檢定規(guī)程可知，50 mL的A級(jí)酸式滴定管的最大允許差為±0.05 mL，滴定體積平均為37.25 mL，按照矩形分布計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.2.5 測(cè)量重復(fù)性帶來(lái)的不確定度分量

測(cè)量重復(fù)性帶來(lái)的不確定度分量ur5為0.001（主要包括人員、環(huán)境、測(cè)量方法和儀器重復(fù)性等其他分量帶來(lái)的不確定度），則標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液所引入的不確定度為：

3.3 氯化銨標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度分量urel2

本次校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)使用的氯化銨標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)編號(hào)為GBW06103，由國(guó)防科技工業(yè)應(yīng)用化學(xué)一級(jí)計(jì)量站提供。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)證書(shū)得出其相對(duì)擴(kuò)展不確定度urel=0.08%，k=2，則標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度分量為：

3.4 分析儀器的不確定度分量urel3

在同一條件下，使用凱氏定氮儀對(duì)消解的5組平行樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表1所示。

表1 大豆粉中蛋白質(zhì)的測(cè)量結(jié)果表

根據(jù)試樣分析結(jié)果，可計(jì)算出蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)差s為：

其標(biāo)準(zhǔn)不確定度和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：

3.5 樣品稱(chēng)量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量urel4

根據(jù)該天平檢定證書(shū)可知，在0～50 g稱(chēng)量范圍內(nèi)，天平的最大允許誤差為0.000 5 g，采用矩形分布計(jì)算稱(chēng)樣量為0.471 4 g時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.6 合成標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)展不確定度評(píng)定

實(shí)驗(yàn)分析得到的不確定度分量之間互不相關(guān)，則使用凱氏定氮法測(cè)定大豆粉中的蛋白質(zhì)的合成標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)展不確定度為：

3.7 擴(kuò)展不確定度評(píng)定及結(jié)果分析

假設(shè)測(cè)量過(guò)程中的誤差屬于正態(tài)分布，取包含因子k=2（置信區(qū)間為95%），則大豆粉中蛋白質(zhì)的含量擴(kuò)展不確定度為：U=k×uc=0.10×2=0.20。全自動(dòng)凱氏定氮儀法測(cè)量大豆粉中蛋白質(zhì)含量結(jié)果表示為X=（32.69±0.20）g/100 g，k=2（置信區(qū)間為95%）。

4 結(jié)語(yǔ)

本研究通過(guò)建立數(shù)學(xué)模型計(jì)算出蛋白質(zhì)的含量，并從標(biāo)準(zhǔn)溶液、氯化銨標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、實(shí)驗(yàn)分析儀器以及樣品稱(chēng)量等不確定因素分析大豆粉中蛋白質(zhì)的不確定度，其中標(biāo)準(zhǔn)溶液和實(shí)驗(yàn)分析儀器是不確定度的主要影響因素。因此在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，應(yīng)確保標(biāo)準(zhǔn)溶液配制的準(zhǔn)確性和實(shí)驗(yàn)分析儀器的穩(wěn)定性。當(dāng)使用儀器時(shí)，應(yīng)提前配制好實(shí)驗(yàn)試劑，在做大批量實(shí)驗(yàn)前，應(yīng)對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器回收率進(jìn)行測(cè)量校準(zhǔn)，確保實(shí)驗(yàn)儀器的回收率和穩(wěn)定性滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)要求，降低不確定度，提高實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。