陳炎鋒 何孝永

膀胱尿路上皮細(xì)胞癌（bladder urothelial carcinoma，BLCA）是最常見的惡性腫瘤之一，具有較高的復(fù)發(fā)率和死亡率[1]。目前雖有大量研究對BLCA的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移機(jī)制等作了探討，但是對BLCA的分子特征仍然未知。筆者認(rèn)為，篩選鑒定BLCA相關(guān)腫瘤標(biāo)志物并探究相關(guān)機(jī)制，將有助于發(fā)現(xiàn)新的治療方案。脯氨酰3-羥化酶（prolyl 3-hydroxylase，P3H）主要包括 P3H1、P3H2、P3H3、P3H4、CRTAP，其中P3H4已被證實與泌尿系腫瘤相關(guān)[2]。目前關(guān)于不同P3H家族基因在BLCA的發(fā)生、發(fā)展中的具體作用尚未知曉。因此，本研究對不同P3H家族基因在BLCA組織中的表達(dá)及其預(yù)后意義作一探討，以期為BLCA的臨床診治提供參考。

1 對象和方法

1.1 對象 從癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫（https://portal.gdc.cancer.gov/）和GTEx數(shù)據(jù)庫獲取435例BLCA患者的臨床數(shù)據(jù)，其中男309例，女126例；年齡69（60，77）歲；腫瘤TNM分期：Ⅰ期25例，Ⅱ期130例，Ⅲ期142例，Ⅳ期138例。

1.2 數(shù)據(jù)獲取 （1）BLCA與癌旁正常組織中P3H家族基因表達(dá)水平的數(shù)據(jù)：使用UCSC XENA（https://xenabrowser.net/datapages/）經(jīng)Toil流程統(tǒng)一處理的TPM格式的RNAseq數(shù)據(jù)并進(jìn)行l(wèi)og2轉(zhuǎn)化后獲得。（2）臨床相關(guān)性及預(yù)后分析數(shù)據(jù)：將數(shù)據(jù)庫中HTSeq-FPKM格式的RNAseq數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成TPM格式，并進(jìn)行l(wèi)og2轉(zhuǎn)化后獲得。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用R 3.6.3統(tǒng)計軟件。不符合正態(tài)分布的計量資料組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗。以P3H家族基因表達(dá)水平的中位數(shù)為分界點(diǎn)分為高、低表達(dá)組，繪制Kaplan-Meier生存曲線并采用log-rank檢驗比較兩組總體生存率。繪制ROC曲線分析P3H家族基因表達(dá)水平預(yù)測患者預(yù)后的效能，AUC為0.5～＜0.7提示有較低的準(zhǔn)確度，0.7～0.9提示有一定的準(zhǔn)確度，＞0.9提示有較高的準(zhǔn)確度。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BLCA與癌旁正常組織中P3H家族基因表達(dá)水平比較 與癌旁正常組織比較，P3H1、P3H4在BLCA組織中的表達(dá)水平均明顯升高，P3H2、P3H3、CRTAP在BLCA組織中的表達(dá)水平均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均 P＜0.05），見圖 1（插頁）。

圖1 膀胱尿路上皮細(xì)胞癌（BLCA）與癌旁正常組織中脯氨酰3-羥化酶（P3H）家族基因表達(dá)水平比較（*P＜0.05）

2.2 不同TNM分期的BLCA患者P3H家族基因表達(dá)水平比較 不同TNM分期的BLCA患者P3H1、P3H3、P3H4、CRTAP表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），其中Ⅰ期和Ⅱ期患者的P3H3、P3H4表達(dá)水平較Ⅲ、Ⅳ期患者明顯降低（均P＜0.05），Ⅱ期患者的P3H1、CRTAP表達(dá)水平較Ⅲ、Ⅳ期患者明顯降低（均P＜0.05）；不同TNM分期的BLCA患者P3H2表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖2（插頁）。

圖2 不同TNM分期的膀胱尿路上皮細(xì)胞癌（BLCA）患者脯氨酰3-羥化酶（P3H）家族基因表達(dá)水平比較（*P＜0.05，△P＞0.05）

2.3 P3H家族基因表達(dá)水平與BLCA患者預(yù)后的關(guān)系及預(yù)測效能分析 Kaplan-Meier生存分析顯示，P3H1、P3H3、P3H4、CRTAP基因表達(dá)水平與BLCA患者的預(yù)后有關(guān)，高表達(dá)組總體生存率更低（均P＜0.05）；而P3H2基因表達(dá)水平與BLCA患者的預(yù)后無關(guān)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖 3。ROC曲線分析顯示，P3H1、P3H2、P3H3、P3H4、CRTAP預(yù)測BLCA患者的預(yù)后均有一定的準(zhǔn)確度，但預(yù)測趨勢方向不一致，其中P3H1、P3H4預(yù)測方向一致，而P3H2、P3H3、CRTAP預(yù)測方向一致。與P3H1（AUC=0.774）相比，P3H4（AUC=0.837）的預(yù)測效能更高；與 P3H3（AUC=0.643）和 P3H2（AUC=0.724）比較，CRTAP（AUC=0.825）的預(yù)測效能更高，見圖 4。

圖3 膀胱尿路上皮細(xì)胞癌（BLCA）患者脯氨酰 3- 羥化酶（P3H）家族基因高、低表達(dá)組的生存曲線（a：P3H1；b：P3H2；c：P3H3；d：P3H4；e：CRTAP）

圖4 不同脯氨酰3-羥化酶（P3H）家族基因預(yù)測膀胱尿路上皮細(xì)胞癌（BLCA）患者預(yù)后的的ROC曲線（a：P3H1、P3H4；b：P3H2、P3H3、CRTAP）

3 討論

既往研究表明，P3H家族基因及其突變與人類疾病有關(guān)，其根本原因主要與膠原蛋白改變有關(guān)[3]。目前已在人類基因組中鑒定出5種P3H家族蛋白，即P3H1、P3H2、P3H3、P3H4、CRTAP，均屬于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留蛋白，其中P3H1、P3H2和P3H3均具有高度保守的2-酮戊二酸，抗壞血酸和Fe（Ⅱ）依賴性雙加氧酶結(jié)構(gòu)域，可以羥化特定脯氨酸殘基；而P3H4、CRTAP（軟骨相關(guān)的蛋白）缺少酶結(jié)構(gòu)域，但與P3H其他家族基因的N端部分具有顯著相似性[4]。盡管已明確P3H家族某些成員在BLCA中起關(guān)鍵作用[2，5]，但仍需要闡明P3H家族成員在BLCA中的不同作用。因此，本研究對不同P3H家族基因在BLCA中的表達(dá)及預(yù)后意義作一探討。

本研究結(jié)果顯示，P3H1、P3H4在BLCA組織中表達(dá)明顯升高，而P3H2、P3H3、CRTAP在BLCA組織中的表達(dá)明顯低于癌旁正常組織。對于不同TNM分期患者，BLCA 組織中 P3H1、P3H3、P3H4、CRTAP 表達(dá)存在明顯差異，而預(yù)后分析顯示P3H家族基因高表達(dá)與BLCA患者總體生存率較低有關(guān)；此外，P3H2與BLCA患者的TNM分期及生存預(yù)后均無關(guān)，原因可能是P3H2僅在膠原蛋白鏈組裝、穩(wěn)定性和交聯(lián)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[6]。本研究ROC曲線分析顯示，不同P3H基因的預(yù)測趨勢方向并不一致，這可能與其是促癌基因還是抑癌基因有關(guān)。P3H3、P3H2、CRTAP的預(yù)測趨勢方向一致，其中CRTAP的預(yù)測效能更高。研究表明，CRTAP和P3H1在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中形成穩(wěn)定的三聚體復(fù)合物脯氨酰3-羥基化復(fù)合物，該復(fù)合物還包含親環(huán)蛋白B、脯氨酰順反異構(gòu)酶[7]，對于適當(dāng)?shù)哪z原蛋白修飾和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的折疊至關(guān)重要。而P3H3、P2H2同樣是適當(dāng)?shù)哪z原生物合成、折疊和組裝所必需的，當(dāng)編碼P3H2的基因突變與至少2個不同家族中的隱性嚴(yán)重近視有關(guān)，并可能影響眼睛的膠原蛋白修飾[8-9]。此外，P3H2、P3H3、CRTAP 基因的表觀失活與腫瘤的發(fā)生有關(guān)，這表明它可能作為腫瘤抑制因子發(fā)揮作用，但具體機(jī)制仍未知[3]。此外，P3H1與P3H4的預(yù)測趨勢方向一致，其中P3H4的預(yù)測效能更高；這與Hao等[10]研究結(jié)果相似。Chen等[2]研究發(fā)現(xiàn)，升高的TPST1或P3H4表達(dá)與總體生存率較低、腫瘤病理分期較高等顯著相關(guān)。P3H4不僅在BLAC組織中高表達(dá)，且具有較高的臨床預(yù)后及腫瘤預(yù)測價值。P3H4最初被鑒定為與締合復(fù)合體（SC）相關(guān)的蛋白質(zhì)[4]，參與多種生理過程，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中纖維狀膠蛋白翻譯后修飾，與P3H3形成穩(wěn)定的復(fù)合物，可催化膠原蛋白α鏈中賴氨酸殘基的羥基化，與賴氨酰羥化酶1和親環(huán)蛋白B相互作用來調(diào)節(jié)骨量穩(wěn)態(tài)和皮膚脆弱性[11-12]。此外，P3H4還可以作為銜接蛋白，連接髓磷脂蛋白零（P0）及活化的蛋白激酶C受體），從而降低P0的磷酸化和黏附功能，誘發(fā)遺傳性周圍神經(jīng)病變[13]。隨后研究發(fā)現(xiàn)，P3H4與間質(zhì)性膀胱炎、膜性腎病、前列腺癌等疾病相關(guān)的自身抗原有關(guān)，而泌尿系統(tǒng)的自身免疫性破壞在BLCA發(fā)病機(jī)制中至關(guān)重要[2，4]。

綜上所述，在BLCA的發(fā)生、發(fā)展過程中，P3H2、P3H3、CRTAP可能作為抑癌基因而P3H1、P3H4可能作為促癌基因發(fā)揮作用，其中P3H4對BLCA患者預(yù)后的預(yù)測價值較高。但本研究也存在一定的局限性，如所有數(shù)據(jù)來自數(shù)據(jù)庫、未評估P3H家族基因在BLCA中的潛在診斷及治療作用等。