李翠，李林樾，馬鵬飛，楊曉莉

陜西省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥品微生物檢測(cè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710065

隨著科技的進(jìn)步，人們眼睛接觸電子屏幕的時(shí)間大大增加，致使人們眼部肌肉疲勞，視力下降、眼干、眼澀等癥狀層疊而出，眼部保健用品就應(yīng)運(yùn)而生［1］，眼部保健眼貼類產(chǎn)品作為常用的保健用品，因其含有豐富的中藥和營(yíng)養(yǎng)成分，再加上其存放和生產(chǎn)過(guò)程中無(wú)法達(dá)到無(wú)菌條件，所以極易滋生微生物。霉菌和酵母菌很容易感染藥物和食品的致病菌，對(duì)動(dòng)物和人類的健康都會(huì)造成嚴(yán)重威脅［2-3］，而眼部保健用品因其特殊的使用部位，一旦污染霉菌或酵母菌，將嚴(yán)重危害使用者的身體健康。所以，規(guī)范此類產(chǎn)品的霉菌和酵母菌的檢測(cè)方法，保證其產(chǎn)品的微生物質(zhì)量可控，勢(shì)在必行［4-11］。

目前，保健用品執(zhí)行的是地方標(biāo)準(zhǔn)，但在《DB61陜西省地方標(biāo)準(zhǔn) 保健用品微生物限度檢查》中并沒(méi)有對(duì)保健用品眼貼制劑微生物限度檢查的霉菌和酵母菌定性檢驗(yàn)方法進(jìn)行規(guī)定。國(guó)內(nèi)其他省份的地方標(biāo)準(zhǔn)也無(wú)單獨(dú)針對(duì)保健用品眼貼制劑的霉菌和酵母菌數(shù)的定性檢驗(yàn)方法，急需摸索建立一種準(zhǔn)確有效、適合此類產(chǎn)品的霉菌和酵母菌數(shù)定性檢測(cè)方法。本文選擇兩個(gè)不同品牌4 類保健用品眼貼類產(chǎn)品進(jìn)行試驗(yàn)，建立了保健用品眼貼類制劑的霉菌和酵母菌數(shù)定性檢查方法［12-14］。

1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

SWW.105 臥式矩形壓力蒸汽滅菌器，上海華成醫(yī)用核子儀器公司；BS2202S 型電子天平，德國(guó)賽多利斯公司；HFsafe-1200LC 型生物安全柜，上海力申科學(xué)儀器有限公司；SHA-C 型水浴恒溫振蕩器，天津鑫博得有限公司；LRH-250 生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；MJ-250-11 霉菌培養(yǎng)箱，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；VITEK2 全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)，法國(guó)梅里埃有限公司；OLYMPUS.CH 型三目顯微鏡，日本奧林巴斯公司；渦旋混合器，德國(guó)IKA 公司。

1.2 樣品信息及編號(hào)

A 牌中老年眼貼。規(guī)格：6 g/貼；實(shí)驗(yàn)編號(hào)及批號(hào)（T1：20180911，T2：20180918，T3：20181014，T4：20181117，T5：20181202）。

A 牌舒緩護(hù)眼貼。規(guī)格：6 g/貼；實(shí)驗(yàn)編號(hào)及批號(hào)（T6：20180526，T7：20180610，T8：20180622，T9：20180623，T10：20180703）。

A 牌明目貼。規(guī)格：2 g/貼；實(shí)驗(yàn)編號(hào)及批號(hào)（T11：20180820，T12：20180908，T13：20180915，T14：20181015，T15：20181115）。

B 牌護(hù)視明目罩。規(guī)格：3.5 g/貼；實(shí)驗(yàn)編號(hào)及批號(hào)（T16：20180701，T17：20180801，T18：20180901，T19：20180701，T20：20180801）。

1.3 培養(yǎng)基及試劑

霉菌液體培養(yǎng)基（青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司，批號(hào)20180730）；0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液（國(guó)藥集團(tuán)，批號(hào)20180926）；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB，北京陸橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)180527）；沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（SDB，北京陸橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)180801）；孟加拉紅培養(yǎng)基（北京陸橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)180628）；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA，北京陸橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)180612）；玉米粉培養(yǎng)基（北京陸橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)181207）；高鹽察氏培養(yǎng)基（北京陸橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)20180923）；氯化三苯四氮唑-沙保羅培養(yǎng)基（北京陸橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)181009）。配制好的培養(yǎng)基適用性檢查符合《中國(guó)藥典》2020 年版非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：計(jì)數(shù)檢查法（通則1105）要求。

1.4 菌種及菌液制備

1.4.1 菌種金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus〔CMCC(B) 26 003〕、銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa〔CMCC(B) 10 104〕、枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis〔CMCC(B) 63 501〕、白色念珠菌Candida albicans〔CMCC(F) 98 001〕、黑曲霉Aspergillus niger〔CMCC(F) 98 003〕，上述標(biāo)準(zhǔn)菌株均來(lái)自中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心，工作用菌株為第3 代。

1.4.2 菌液制備參照《中國(guó)藥典》2020 版進(jìn)行菌液制備：將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌分別接種于胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)24 h；將白色念珠菌接種于沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，25 ℃培養(yǎng)3 d。上述培養(yǎng)物用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的菌懸液；將黑曲霉接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)7 d，加入5 mL 含0.05%聚山梨酯80 的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，洗脫孢子，收集孢子懸液，用含0.05%聚山梨酯80 的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的孢子懸液。

2 實(shí)驗(yàn)方法

全過(guò)程進(jìn)行陰性對(duì)照試驗(yàn)，陰性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。

2.1 供試液制備

取樣品10 g，加0.9%氯化鈉溶液至100 mL，45 ℃恒溫水浴振蕩10 min 使其分散均勻，制成1∶10供試液。

2.2 試驗(yàn)過(guò)程

2.2.1 分離平板篩選（1）接種與增菌培養(yǎng)。取制備好的1∶10 供試液，接入含菌量不大于100 cfu 的白色念珠菌菌液和黑曲霉試驗(yàn)菌液混勻。分別取上述勻液10 mL 接種至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）增菌肉湯、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（SDB）增菌肉湯和霉菌液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。（2）選擇和分離培養(yǎng)。取上述培養(yǎng)物劃線分離于孟加拉紅瓊脂平板上、氯化三苯四氮唑-沙保羅瓊脂平板、沙氏葡萄糖瓊脂（SDA）平板、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）平板、察氏瓊脂平板、高鹽察氏培養(yǎng)基、玉米瓊脂平板上，25 ℃培養(yǎng)3 d，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 霉菌和酵母菌在不同分離平板上的分離結(jié)果

取增菌液分離于上述7 種分離平板，結(jié)果在孟加拉紅瓊脂平板、SDA 瓊脂平板和PDA 瓊脂平板上菌落大、形態(tài)典型，便于觀察，反之在高鹽察氏瓊脂平板、察氏瓊脂平板、玉米瓊脂平板、氯化三苯四氮唑-沙保羅瓊脂平板上生長(zhǎng)的菌落形態(tài)小，不易觀察。因此，初步選定分離平板為孟加拉紅瓊脂平板、SDA 瓊脂平板和PDA 瓊脂平板。

2.2.2 增菌培養(yǎng)液的篩選（1）接種與增菌培養(yǎng)。取制備好的1∶10 供試液，接入含菌量不大于100 cfu的白色念珠菌菌液和黑曲霉試驗(yàn)菌液，同時(shí)接入含菌量大于100 cfu 的革蘭氏陽(yáng)性菌（金黃色葡萄球菌）、革蘭氏陰性菌（大腸埃希菌）、芽孢桿菌（枯草芽孢桿菌）混勻。分別取上述勻液10 mL 接種至90 mL TSB 增菌肉湯、SDB 增菌肉湯、霉菌液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)。（2）選擇和分離培養(yǎng)。取上述培養(yǎng)物劃線分離于孟加拉紅瓊脂平板上、SDA 平板、PDA 平板上，25 ℃培養(yǎng)72 h。結(jié)果見(jiàn)表2。（3）結(jié)果。取供試液接種至上述3 種增菌培養(yǎng)基進(jìn)行增菌培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h 內(nèi)在霉菌液體培養(yǎng)基中就可見(jiàn)明顯的霉菌菌絲生長(zhǎng)，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)72 h 增菌液混濁且菌絲越來(lái)越豐富，而在TSB 增菌液和SDB增菌液中，需要培養(yǎng)48 h 才出現(xiàn)混濁及可見(jiàn)霉菌菌絲生長(zhǎng)，表明霉菌液體培養(yǎng)基的靈敏性要優(yōu)于其他兩種增菌培養(yǎng)基。將上述三種增菌液分別分離于初選的孟加拉紅瓊脂平板、SDA 平板和PDA 平板，霉菌和酵母菌均生長(zhǎng)良好，但在SDA 平板上也可見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)，而因孟加拉紅瓊脂和PDA 瓊脂的配方中添加了一定量的抗生素，不僅對(duì)霉菌和酵母菌有較好的促生長(zhǎng)能力，且抑制了細(xì)菌的生長(zhǎng)。

表2 霉菌和酵母菌在不同增菌液培養(yǎng)的試驗(yàn)結(jié)果

2.2.3 培養(yǎng)溫度、時(shí)間的考察溫度對(duì)霉菌的繁殖及產(chǎn)毒均有重要的影響［15］，不同種類的霉菌最適溫度是不一樣的［16］，大多數(shù)霉菌繁殖最適宜的溫度為25 ℃～30 ℃。將不大于100 cfu 的白色念珠菌菌液和黑曲霉試驗(yàn)菌液接種至霉菌液體培養(yǎng)基中，分別于25 ℃和28 ℃培養(yǎng)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 兩種培養(yǎng)溫度下培養(yǎng)結(jié)果

將增菌培養(yǎng)液置25 ℃和28 ℃兩種溫度的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，在28 ℃培養(yǎng)24 h 就可見(jiàn)絮狀菌絲生長(zhǎng)，28 ℃培養(yǎng)48 h，增菌液出現(xiàn)明顯的混濁，菌絲豐富，而在25 ℃需要培養(yǎng)至48 h 才出現(xiàn)混濁，可見(jiàn)菌絲生長(zhǎng)。試驗(yàn)菌在28 ℃培養(yǎng)48 h 的培養(yǎng)條件下表現(xiàn)出了良好的促生長(zhǎng)能力，滿足了在最短時(shí)間內(nèi)提高檢出率的要求，培養(yǎng)效果優(yōu)于25 ℃培養(yǎng)48 h，所以選擇28 ℃作為增菌培養(yǎng)溫度。

2.2.4 分離方式、分離平板數(shù)目及分離培養(yǎng)時(shí)間考察采用劃線和涂布分離的方法對(duì)樣品進(jìn)行分離培養(yǎng)，比較兩種分離方式的回收率。（考慮樣品的檢出率，劃線分離用10 μL 的接種環(huán)分別取增菌液一環(huán)劃線于3 塊同種分離平板；涂布法采用取增菌液1 mL 分別以0.3 mL/皿、0.3 mL/皿、0.4 mL/皿，涂布于3 塊同種分離平板）。（1）接種與增菌培養(yǎng)。取制備好的1∶10 供試液，接入含菌量不大于100 cfu的白色念珠菌菌液和黑曲霉試驗(yàn)菌液，混勻，取上述勻液10 mL 接種至霉菌液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)，作為試驗(yàn)組；接入含菌量不大于100 cfu 的白色念珠菌菌液和黑曲霉試驗(yàn)菌液至霉菌液體培養(yǎng)基中，作為菌液對(duì)照組；取制備好的1∶10 供試液10 mL，接種至霉菌液體培養(yǎng)基中，作為樣品組。（2）選擇和分離培養(yǎng)。取上述培養(yǎng)物分別采用劃線和涂布的方式分離于孟加拉紅瓊脂平板和PDA 瓊脂平板上，28 ℃培養(yǎng)7 d，逐天觀察。結(jié)果：取增菌液選擇涂布分離或是劃線分離到一塊選擇性平板上，檢出率均較低，易造成漏檢。采用涂布的方法接種在三塊孟加拉紅瓊脂平板和PDA 瓊脂平板上進(jìn)行霉菌和酵母菌的分離，檢出率明顯優(yōu)于劃線的分離方式。分離培養(yǎng)24 h～7 d 時(shí)，觀察到目標(biāo)菌落生長(zhǎng)區(qū)別不明顯，所以實(shí)際操作過(guò)程中可結(jié)合實(shí)際需求，建議分離培養(yǎng)時(shí)間控制在72 h～5 d。

3 結(jié)果

首先通過(guò)不同培養(yǎng)基對(duì)目標(biāo)菌群的增菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)霉菌液體培養(yǎng)基的增菌效果較好，接著通過(guò)分離培養(yǎng)基的篩選試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基和PDA 培養(yǎng)基的分離平板上的菌落大、形態(tài)典型，選擇性較好，進(jìn)一步進(jìn)行了分離方式以及分離平板數(shù)目的考察，確立選擇采用涂布分離的方式，分別取1 mL 接種于兩種培養(yǎng)基，每種培養(yǎng)基分離于三塊平板，最終建立了保健用品眼貼制劑霉菌和酵母菌定性檢查的方法。此方法通過(guò)反復(fù)試驗(yàn)，操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、結(jié)果可靠，可滿足生產(chǎn)企業(yè)對(duì)產(chǎn)品的質(zhì)量控制，且可達(dá)到DB61 陜西省地方標(biāo)準(zhǔn)保健用品微生物限度檢查中對(duì)于眼貼類產(chǎn)品霉菌和酵母菌數(shù)結(jié)果不得檢出的標(biāo)準(zhǔn)要求。

4 討論

眼貼作為眼部保健類產(chǎn)品，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于中老年以及青少年的眼部保?。?7］，市面上也出現(xiàn)了讓人眼花繚亂的眼部保健產(chǎn)品［18］，陜西作為保健用品的生產(chǎn)大省，其保健用品的生產(chǎn)檢驗(yàn)也受到了各生產(chǎn)單位及監(jiān)管檢驗(yàn)部門(mén)的重視。生產(chǎn)單位在按照地方標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行保健用品眼貼類產(chǎn)品的檢驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)［19-20］，在現(xiàn)有的生產(chǎn)環(huán)境下無(wú)法滿足地方標(biāo)準(zhǔn)對(duì)該制劑的標(biāo)準(zhǔn)要求［21］，而地方標(biāo)準(zhǔn)在該類制劑霉菌和酵母菌的檢測(cè)方法項(xiàng)下也未明確給出具體的檢測(cè)方法，國(guó)家也未有相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)出臺(tái)，企業(yè)產(chǎn)品的生產(chǎn)、檢驗(yàn)、流通受到了極大的限制。

本研究通過(guò)對(duì)增菌培養(yǎng)液的篩選、分離培養(yǎng)基的篩選、培養(yǎng)條件的篩選、分離方式以及分離平板數(shù)目的考察一系列試驗(yàn)，初步建立了保健用品眼貼制劑的霉菌和酵母菌數(shù)定性檢測(cè)方法，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于陜西的保健用品生產(chǎn)單位。該方法的建立解決了生產(chǎn)企業(yè)有標(biāo)準(zhǔn)無(wú)方法，無(wú)法檢驗(yàn)的困擾，完善了陜西地方標(biāo)準(zhǔn)保健用品眼貼類制劑的霉菌和酵母菌數(shù)檢查方法，也為今后陜西地方標(biāo)準(zhǔn)《保健用品微生物限度檢查》的標(biāo)準(zhǔn)更新提供參考，為保健用品國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考。

隨著保健用品消費(fèi)群體的增多，保健用品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)范也受到大家的重視，而國(guó)家尚無(wú)統(tǒng)一的保健用品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，建議盡快出臺(tái)統(tǒng)一的保健用品國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)范市場(chǎng)，保證人民用藥安全，保證消費(fèi)者的用藥權(quán)益。