歐鵬程 姚杰 吳敏娜 楊智 謝帆慈

摘? 要：目的? 探討分析管花苷B對肝癌細胞增殖侵襲轉移的影響及作用機制。方法? 取人肝癌細胞株HepG2，隨機分為對照組和管花苷B不同濃度組，對照組中僅加入細胞培養(yǎng)液，管花苷B不同濃度組中分別加入1 mg/L、10 mg/L、100 mg/L的管花苷B和細胞培養(yǎng)液。采用MTT法測算細胞增殖抑制率;采用Transwell小室實驗檢測HepG2細胞的體外侵襲、轉移能力;采用流式細胞儀檢測細胞周期，Westem blot法檢測RCD44的表達。結果? 細胞增殖抑制率隨管花苷B濃度的升高而增大;細胞侵襲和轉移能力均隨管花苷B濃度的升高而降低;與對照組相比，各濃度的管花苷B均可顯著增加GO/G1期肝癌細胞的比例，減少S期與G2/M期肝癌細胞的比例;肝癌細胞CD44蛋白表達量隨管花苷B濃度和作用時間的增加而減少。結論? 管花苷可明顯抑制肝癌細胞增殖侵襲轉移，且具有明顯的濃度依賴性，其機制可能與管花苷B可影響細胞周期進程和下調CD44蛋白表達有關。

關鍵詞：管花苷B;肝癌細胞;增殖;侵襲;轉移;作用機制

中圖分類號：R725.6? ? 文獻標識碼：A? ? 文章編號：1009-8011（2021）-17-0157-03

肝癌是常見的惡性腫瘤之一，全球發(fā)病率呈逐年上升趨勢，躍居全球癌癥發(fā)病率第5位，病死率為惡性腫瘤致死病因的第2位[1]。外科手術是治療肝癌最有效的方法，但肝癌起病隱匿，多數(shù)患者就診時已為中晚期，出現(xiàn)腫瘤的遠處侵襲和轉移，已失去根治性切除的機會，部分患者即使可局部切除病灶，但術后復發(fā)、轉移是導致治療效果不理想、預后差的主要原因，因此尋找有效抑制肝癌轉移的藥物對提高患者預后具有重要的臨床意義。管花苷B是從肉蓯蓉屬植物管花肉蓯蓉中分離得到的一種苯乙醇苷類化合物，近年來大多學者對管花苷B的藥理學研究主要集中在抗氧化、抗衰老、抗炎、神經保護、保肝等方面[2]。然而其抗腫瘤作用的研究鮮少報道，本研究以人肝癌細胞株HepG2為研究對象，通過觀察管花苷B對肝癌HepG2細胞增殖侵襲轉移的影響，探討管花苷B抗肝癌作用的可能機制，為抗肝癌的藥物研究提供理論依據(jù)。

1? 資料與方法

1.1? 材料與儀器

人肝癌細胞株HepG2（中科院上海細胞生物研究所），管花苷B（生產企業(yè)：成都格普特生物科技有限公司，CAS號112516-

04-8），DMEM培養(yǎng)液（生產企業(yè)：武漢純度生物科技有限公司）、胎牛血清（生產企業(yè)：上海麥克林生化科技有限公司），胰酶、青霉素-鏈霉素（生產企業(yè)：北京索萊寶科技有限公司），二甲基亞砜（DMSO，生產企業(yè)：上海吉至生化科技有限公司），Transwell（生產企業(yè)：上海惠研生物科技有限公司），Matrigel基質膠（生產企業(yè)：BD公司），細胞周期試劑盒（生產企業(yè)：碧云天生物技術有限公司），流式細胞儀（生產企業(yè)：廣州濟恒醫(yī)藥科技有限公司），CD44、抗肌動蛋白（β-actin）（生產企業(yè)：南京善本生物科技有限公司），BCA蛋白濃度檢測試劑盒、辣根標記山羊抗兔IgG二抗（生產企業(yè)：武漢科斯坦生物科技有限公司）。

1.2? 方法

1.2.1? 細胞培養(yǎng)及分組

將HepG2細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、青霉素-鏈霉素各100 μg/mL的DMEM培養(yǎng)液中，置于37 ℃的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，待細胞生長貼壁達90%融合狀態(tài)時進行細胞傳代，取對數(shù)生長期細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2? 細胞增殖抑制率測算

采用MTT法測算細胞增殖抑制率。將HepG2細胞按2×105/mL接種于96孔板，每組5孔。待細胞貼壁后吸凈上清液，并分為兩組，對照組僅加入細胞培養(yǎng)液，管花苷B組中分別加入1 mg/L、10 mg/L、100 mg/L的管花苷B和細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后，分別加入5 g/L的MTT20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液后加入200 μL的DMSO，震蕩15 min，采用酶聯(lián)免疫檢測儀測波長為490 mm時各組吸光密度（OD）值，計算各組細胞增殖抑制率。計算公式如下：細胞增殖抑制率=（1-給藥組OD/對照組OD）×100%。

1.2.3? 細胞侵襲能力實驗

采用Transwell小室法檢測細胞細胞侵襲能力。在預冷的Transwell小室中加入稀釋好的Matrigel基質膠50 μL，37 ℃培養(yǎng)2 h待其凝固。取各組HepG2細胞制成細胞密度為4×104/mL的懸液待用。在Transwell小室上室中加入用DMEM培養(yǎng)液（含0.1%胎牛血清）稀釋的HepG2細胞懸液200 μL，下室中加入500 μLDMEM培養(yǎng)液（含20%胎牛血清），繼續(xù)培養(yǎng)24 h后使用4%多聚甲醛固定，0.1%結晶紫染色，在顯微鏡下拍照，并觀察穿模細胞數(shù)，記錄5個高倍鏡下視野細胞數(shù)，取平均值。

1.2.4? 細胞轉移能力

操作步驟同細胞侵襲能力實驗，但實驗中未加入Matrigel基質膠。

1.2.5? 細胞周期檢測

收集經不同條件處理后的細胞懸液，置于1000 r/min的離心機內離心5 min，棄培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，再次離心去除PBS后使用70%乙醇固定，4 ℃保存過夜后離心去上清液，采用流式細胞儀檢測細胞周期，用FlowJo軟件處理數(shù)據(jù)，并分析不同周期細胞的數(shù)量。

1.2.6? 細胞中CD44蛋白表達檢測

采用Westem blot法檢測細胞中CD44蛋白表達。取各組處理24 h、48 h后的細胞，分別加入細胞裂解液提取細胞總蛋白，嚴格按照BCA試劑盒說明測定蛋白濃度。取50 μL總蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜，封閉2 h后孵育一抗（CD44抗體，β-actin抗體）;4 ℃孵育過夜，TBST洗滌后加入二抗（辣根標記山羊抗兔IgG），室溫孵育1.5 h，TBST洗滌后加入ECL發(fā)光液曝光，利用Image J軟件分析CD44蛋白表達灰度值。

1.3? 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行處理數(shù)據(jù)，計量資料采用（x±s）表示，組間比較行t檢驗、單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2? 結果

2.1? 各組細胞增殖抑制率對比

細胞增殖抑制率隨管花苷B濃度的升高而增大。見表1。

2.2? 各組細胞侵襲和轉移能力對比

細胞侵襲和轉移能力均隨管花苷B濃度的升高而降低。見表2。

2.3? 管花苷B對肝癌細胞周期的影響

與對照組相比，各濃度的管花苷B均可顯著增加GO/G1期肝癌細胞的比例，減少S期與G2/M期肝癌細胞的比例。見表3。

2.4? 管花苷B對肝癌細胞CD44蛋白表達的影響

肝癌細胞CD44蛋白表達量隨管花苷B濃度和作用時間的增加而減少。見表4。

3? 討論

肝癌是臨床常見的具有較高發(fā)病率和死亡率的惡性腫瘤之一，肝癌治療效果不理想的主要原因是早期臨床癥狀不明顯，且易發(fā)生侵襲和轉移。調查[3]顯示，超過90%的癌癥患者死于腫瘤轉移，腫瘤轉移提示癌細胞惡性程度提高，治療難度增大，尋找抗肝癌轉移作用的藥物對腫瘤研究領域及癌癥患者具有重大意義。肝癌的轉移涉及多基因、多階段相互作用，逐漸造成細胞表型的改變以提高腫瘤惡性程度，最終實現(xiàn)腫瘤細胞脫離原發(fā)部位，并在轉移部位增殖。腫瘤細胞轉移的復雜過程包括腫瘤細胞脫落和黏附、細胞增殖侵襲轉移、細胞外基質降解、腫瘤血管形成等[4]。研究[5]發(fā)現(xiàn)，在肝癌轉移的過程中，作為介導細胞黏附作用的CD44細胞黏附分子出現(xiàn)明顯的異常表達。CD44細胞黏附分子具有高度異質性，主要分為兩個亞型，CD44s標準型和CD44v變異型，參與機體炎癥反應、傷口愈合、血管生成、癌癥的發(fā)展等多種生理、病理過程[6]。增生的上皮細胞、淋巴細胞中均可檢測到CD44s標準型，而CD44v變異型與腫瘤細胞的發(fā)生、轉移密切相關。相關研究[7]表明，肝癌、肺癌、大腸癌、喉癌、宮頸癌等多種腫瘤細胞的侵襲、轉移與CD44高表達密切相關，且CD44表達程度與患者臨床分期、分化程度存在一定的相關性。研究[8]報道，CD44v變異型高度表達的肝癌患者中多伴有肝內轉移。

本研究通過MTT法、Transwell細胞侵襲和轉移實驗測定了管花苷B對肝癌細胞增殖侵襲轉移的影響，結果顯示，細胞增殖抑制率隨管花苷B濃度的升高而增大，表明管花苷B對肝癌細胞增殖具有明顯抑制作用，且具有明顯的濃度依賴性;細胞侵襲和轉移能力均隨管花苷B濃度的升高而降低，表明1 mg/L、10 mg/L、100 mg/L的管花苷B均對肝癌細胞的侵襲和轉移具有明顯的抑制作用，且管花苷B濃度越高抑制作用越明顯。與對照組相比，各濃度的管花苷B均可顯著增加GO/G1期肝癌細胞比例，減少S期與G2/M期肝癌細胞比例，提示管花苷B可能對細胞周期進程具有一定的影響作用。為進一步探討管花苷B抗肝癌轉移作用機制，我們蛋白表達水平驗證了管花苷B對肝癌細胞中CD44表達的影響，結果顯示，肝癌細胞CD44蛋白表達量隨管花苷B濃度和作用時間的增加而減少，推測管花苷B抑制肝癌細胞的增殖侵襲轉移作用可能通過降低CD44表達而起作用。

綜上所述，管花苷可明顯抑制肝癌細胞增殖侵襲轉移，且具有明顯的濃度依賴性，其機制可能與管花苷B可影響細胞周期進程和下調CD44蛋白表達有關。

參考文獻

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