李迎凱，張健，胡江峰

（1.天津市經(jīng)濟貿(mào)易學(xué)校，天津 300381；2.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457）

糖化酶，全名葡萄糖淀粉酶，是一種外切酶，它可以將淀粉、糊精、糖原等物質(zhì)轉(zhuǎn)化為葡萄糖[1]。糖化酶具有很重要的商業(yè)價值，已經(jīng)在食品、醫(yī)學(xué)、釀造等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[2-5]。

糖化酶生產(chǎn)菌可以從細菌和酵母屬中分離得到[6-8]，但是目前工業(yè)上生產(chǎn)的糖化酶制劑大多來自曲霉和根霉[9-11]，其中黑曲霉（Aspergillus niger）被廣泛應(yīng)用于糖化酶發(fā)酵生產(chǎn)[12-14]。黑曲霉在自然界中廣泛分布，作為一種非常重要的發(fā)酵工業(yè)菌種，可用于大規(guī)模的酶制劑工業(yè)化生產(chǎn)。黑曲霉在糖化酶大規(guī)模生產(chǎn)上優(yōu)勢明顯，其變異小，穩(wěn)定性高，副產(chǎn)物易去除[15-16]。隨著我國淀粉糖行業(yè)的快速發(fā)展，糖化酶的需求量與日俱增。另外，能源和生產(chǎn)原材料價格也在不斷增加，因此，提升該產(chǎn)業(yè)市場競爭力的關(guān)鍵就是提高糖化酶的生產(chǎn)能力，降低生產(chǎn)成本[17-18]。

糖化酶發(fā)酵過程主要是黑曲霉經(jīng)深層通風(fēng)發(fā)酵培養(yǎng)后菌體代謝產(chǎn)生。在菌體生長、代謝產(chǎn)物積累的過程中，發(fā)酵液中溶解氧都需控制在一定范圍內(nèi)，達到產(chǎn)酶轉(zhuǎn)化率的最佳水平，以最低的能源消耗達到最大的產(chǎn)出，即高效生產(chǎn)。眾多研究報道顯示[19-23]，初始培養(yǎng)基的優(yōu)化、不同發(fā)酵容器的優(yōu)化、分批培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)的應(yīng)用，以及培養(yǎng)條件如含水率、溫度、pH值、溶氧、攪拌的優(yōu)化等均可以較好地提高糖化酶的生產(chǎn)水平。但在工業(yè)生產(chǎn)過程中仍然面臨發(fā)酵后期酶活性增加緩慢、轉(zhuǎn)化率低的現(xiàn)象，尤其是發(fā)酵周期比較長的真菌發(fā)酵，在發(fā)酵后期菌絲體生長導(dǎo)致發(fā)酵液黏度增大一直是發(fā)酵行業(yè)普遍存在的問題[24-25]，生理代謝參數(shù)及相關(guān)性的分析已經(jīng)成為進一步優(yōu)化生產(chǎn)控制工藝、提升發(fā)酵水平的關(guān)鍵[26-27]，其中二氧化碳釋放速率（carbon evolution rate，CER）表示細胞代謝過程中CO2的釋放速率，它的水平能夠有效地反映細胞生理代謝狀態(tài)，因此可以作為衡量發(fā)酵水平的重要指標[28]。

本研究通過糖化酶發(fā)酵過程生理代謝參數(shù)的采集系統(tǒng)，利用多參數(shù)相關(guān)分析，考察了不同補料方式與生理代謝參數(shù)的變化，并結(jié)合CER進行補料量的相關(guān)優(yōu)化試驗，以期提高糖化酶產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

糖化酶生產(chǎn)用菌為黑曲霉（Aspergillus niger）：天津市經(jīng)濟貿(mào)易學(xué)校實驗室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：玉米淀粉90 g/L，玉米漿12 g/L，豆餅粉8 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米淀粉200 g/L，玉米粉50 g/L，豆餅粉 12g/L，玉米漿 18g/L，KH2PO410g/L，（NH4）2SO42 g/L，CaCl20.3 g/L，檸檬酸 0.5 g/L，硫酸鉀 5 g/L。

補料培養(yǎng)基：一水葡萄糖500 g/L。

1.2 儀器與設(shè)備

FUS-50L（A）攪拌式生物反應(yīng)器：國強生化裝備有限公司；InPro3100i pH值電極、InPro6860i溶氧電極：梅特勒-托利多儀器有限公司；MAX300-LG過程尾氣質(zhì)譜儀：美國艾科特里爾公司。

1.3 方法

1.3.1 檢測方法

1.3.1.1 糖化酶酶活性的測定

酶活性使用淀粉葡萄糖苷酶（amyloglucosidase，AGI）表示。1個AGI單位定義為在pH值4.3和溫度60℃條件下，每1 min從可溶性淀粉水解生成1 μmol葡萄糖所需的酶的質(zhì)量。50 mg糖化酶標品對應(yīng)大約2 500 AGI。糖化酶酶活性測量：230 μL p-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷試劑（37℃預(yù)熱5 min）與20 μL發(fā)酵上清液混合，37℃反應(yīng)20 min后加入100 μL p-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷試劑，在405nm下測量混合液體吸光度來定量糖化酶。

1.3.1.2 菌體濃度（packed mycelium volume，PMV）的測定

取發(fā)酵液10 mL于離心管中，4 000 r/min離心10 min后，沉淀物占10 mL發(fā)酵液的體積百分比即為菌體濃度。

1.3.1.3 溶氧（dissolved oxygen，DO）的測定

通過溶氧電極在線監(jiān)測溶氧情況。

1.3.1.4 CER的測定

通過過程尾氣質(zhì)譜儀在線監(jiān)測。

1.3.2 發(fā)酵方法

種子培養(yǎng)：在無菌條件下，將斜面上的孢子用去離子水洗下，接入5 L發(fā)酵罐中，裝液量為3 L，培養(yǎng)溫度32℃，攪拌轉(zhuǎn)速240 r/min，罐壓0.05 MPa，發(fā)酵時間48 h，待pH值出現(xiàn)反彈10 h后移種于50 L發(fā)酵罐。

分批培養(yǎng)：將制備好的種子培養(yǎng)液在無菌條件下按接種量10%轉(zhuǎn)入50 L發(fā)酵罐中，初始發(fā)酵體積為25 L，培養(yǎng)溫度維持在34℃，攪拌轉(zhuǎn)速為180 r/min，罐壓0.1 MPa，發(fā)酵過程中通過流加氨水控制pH值為4.7，連續(xù)補料發(fā)酵180 h。發(fā)酵過程中在線監(jiān)測DO和CER，每隔6 h分別取樣檢測PMV及酶活性。

1.3.3 停止補料與降低補料對發(fā)酵后期產(chǎn)酶的影響

分別按照以下補料方式進行發(fā)酵。補料方式1：正常連續(xù)補料發(fā)酵180 h；補料方式2：在發(fā)酵120 h時停止補料，10 h后恢復(fù)補料量為130 mL/h發(fā)酵至180 h；補料方式3：在發(fā)酵120 h時降低補料量到30 mL/h，持續(xù)20 h后恢復(fù)補料量為130 mL/h發(fā)酵至180 h；補料方式4：在發(fā)酵120 h時降低補料量到30 mL/h，持續(xù)10 h后恢復(fù)補料量為130 mL/h發(fā)酵至180 h。

1.3.4 結(jié)合CER的變化趨勢停止與恢復(fù)補料對發(fā)酵后期產(chǎn)酶的影響

在正常連續(xù)補料發(fā)酵過程中監(jiān)測CER變化趨勢，當CER開始出現(xiàn)下降趨勢并持續(xù)36 h后停止補料，直至CER上升為峰值時恢復(fù)補料量為130 mL/h發(fā)酵至180 h。為保證試驗結(jié)果的穩(wěn)定，進行3次發(fā)酵。

2 結(jié)果與分析

2.1 停止補料與降低補料對發(fā)酵后期產(chǎn)酶的影響

不同補料方式下DO、CER、PMV及酶活性變化如圖1所示。

圖1 不同補料方式的DO、CER、PMV及酶活性變化曲線Fig.1 DO，CER，PMV and enzyme activity curves of different dosing mode

由圖1a可以看出補料方式2發(fā)酵168 h后DO開始反彈，而其他補料方式DO并未出現(xiàn)反彈。由圖1b可以看出，除了補料方式1，其余補料方式的CER均在發(fā)酵至138 h時出現(xiàn)反彈，其中，補料方式2發(fā)酵后期的CER值明顯高于其他補料方式。由圖1c可知，對比PMV變化，補料方式2發(fā)酵后期PMV略低于其他補料方式。由圖1d可以看到補料方式2、3、4酶活性在發(fā)酵后期均高于補料方式1，其中補料方式2的酶活性明顯高于其他補料方式，且酶活性一直呈上升趨勢。

綜合以上結(jié)果，補料方式2在發(fā)酵后期DO、CER出現(xiàn)反彈，且酶活性高，說明停止補料有利于菌絲發(fā)生斷裂，使發(fā)酵液黏度下降，從而增加了發(fā)酵罐內(nèi)氧傳遞速率，菌體代謝活力上升，有助于酶活性的增加。補料方式2的最終酶活性比正常發(fā)酵增加了40%。

2.2 結(jié)合CER的變化趨勢停止與恢復(fù)補料對發(fā)酵后期產(chǎn)酶的影響

將3次發(fā)酵的DO、CER、PMV及酶活性變化與補料方式2進行對比，結(jié)果見圖2。

圖2 補料方式2與結(jié)合CER恢復(fù)補料的DO、CER、PMV及酶活性變化曲線Fig.2 DO，CER，PMV and enzyme activity curves by dosing mode 2 and resuming dosing based on CER

由圖2a可知，3次發(fā)酵試驗DO在發(fā)酵132 h后都出現(xiàn)反彈，反彈幅度均高于補料方式2。圖2b說明停止補料與結(jié)合CER恢復(fù)補料的CER都會出現(xiàn)反彈。由圖2c可知，在發(fā)酵156 h后3次發(fā)酵試驗的PMV均低于補料方式2。3次發(fā)酵的酶活性均一直呈上升趨勢（圖2d），且發(fā)酵后期酶活性明顯高于補料方式2。

綜合以上結(jié)果，對比補料方式2，結(jié)合CER來進行補料的停止與恢復(fù)，在發(fā)酵后期DO出現(xiàn)更加明顯的反彈，且PMV也明顯降低，酶活性更高，說明CER下降一段時間后停止補料可以使菌體將培養(yǎng)基中的碳源得到進一步消耗，這樣迫使菌體處于饑餓狀態(tài)，從而菌絲體的斷裂更加充分，發(fā)酵液黏度下降，溶氧開始上升。當在CER反彈到峰值時再恢復(fù)補料，可以使菌體將恢復(fù)的碳源流向產(chǎn)酶代謝途徑，有助于酶活性的增加。3次試驗最終酶活性平均值達到20 895 AGI/mL，比補料方式2增加了18%。

3 結(jié)論

將菌體生理代謝參數(shù)CER與補料方式相結(jié)合成功應(yīng)用于黑曲霉糖化酶的發(fā)酵優(yōu)化過程，結(jié)果表明，在發(fā)酵中后期CER下降36 h時停止補料，一直到CER反彈到峰值恢復(fù)補料，能夠使菌體斷裂更加充分，從而提升了菌體的氧消耗速率，促進糖化酶在發(fā)酵后期依然保持較高的合成速率，3次發(fā)酵最終糖化酶的平均酶活性達到20 895 AGI/mL，對比優(yōu)化之前的正常連續(xù)補料提高了60%。

改變補料方式只是優(yōu)化的開始，在發(fā)酵前期補料量以及發(fā)酵后期如何根據(jù)溶氧水平增加補料量等諸多方面優(yōu)化還需要進一步試驗驗證。本文結(jié)合CER進行補料方式優(yōu)化取得較好的效果，對結(jié)合生理代謝參數(shù)優(yōu)化糖化酶以及其他工業(yè)酶類的發(fā)酵水平具有借鑒意義，并對生產(chǎn)過程也具有指導(dǎo)作用。