羅 君， 曹文海， 鄧 銀， 李小英

（ 湖南展輝食品有限公司， 湖南 長沙 410000）

健康母親每升乳汁含有109個(gè)細(xì)菌， 主要是由雙歧桿菌屬和乳酸桿菌屬組成[1]， 同時(shí)母乳中還含有母乳低聚糖， 其作用主要是經(jīng)腸道微生物發(fā)酵產(chǎn)生短鏈鏈脂肪酸、 促進(jìn)有益微生物的生長、 抑制有害菌的生長繁殖、 保護(hù)腸道上皮組織的完整等。 嬰兒身體內(nèi)益生菌（ 雙歧桿菌和乳桿菌） 的來源主要是通過母乳喂養(yǎng)的形式被給予， 而雙歧桿菌和乳桿菌主要是通過免疫清除、 免疫調(diào)節(jié)等方式對嬰兒腸道的免疫系統(tǒng)起作用， 同時(shí)也會提高胃腸道相應(yīng)的免疫能力[2]。 研究結(jié)果表明， 經(jīng)母乳喂養(yǎng)的寶寶其體內(nèi)益生菌種類相較于奶粉喂養(yǎng)的更多樣化， 主要是包括了腸桿菌和脆弱擬桿菌屬， 添加益生菌在嬰幼兒配方奶粉中有益于腸道微生物的生長繁殖， 如果配方奶粉中不進(jìn)行相應(yīng)的改進(jìn)， 其奶粉中的有益菌明顯少于改進(jìn)配方奶粉[3]。

益生菌是一種有益于宿主健康的活性微生物，能夠使腸道內(nèi)的微生物菌群維持在相對平衡的狀態(tài)[4-6]， 其主要作用是通過促進(jìn)有益菌的生長、 抑制有害菌的增加， 從而提高人體免疫力。 由于生活水平和保健意識的提高， 益生菌因其特別的保健作用而受到人們的廣泛關(guān)注。 目前， 國家衛(wèi)生部要求只能添加以下9 種菌種， 包括嗜酸乳桿菌、 動物雙歧桿菌、 短雙歧桿菌等， 在嬰幼兒配方奶粉中使用較多的是菌種a（動物雙歧桿菌Bb-12） 、 菌種b（ 乳雙歧Bi-07） 、 菌種c（ 嗜酸乳桿菌）[7-9]。 通過加速試驗(yàn)， 分析了添加益生菌的嬰幼兒奶粉在不同的溫度下活菌數(shù)的變化趨勢， 為益生菌奶粉產(chǎn)品的監(jiān)管提供技術(shù)參考和意見。

1 試驗(yàn)部分

1.1 原料

市售的嬰幼兒配方奶粉： 一段（ 高油乳清粉、全脂乳粉、 脫脂乳粉、 乳糖、 碳酸鈣、 復(fù)配礦物質(zhì)、花生四烯酸、 二十二碳六烯酸等， 水分質(zhì)量2.25%） ；二段（水分質(zhì)量2.46%）； 三段（水分質(zhì)量2.52%）。

益生菌： 菌種a（動物雙歧桿菌Bb-12） 、 菌種b（乳雙歧Bi-07）、 菌種c（嗜酸乳桿菌）。

1.2 儀器

分析天平、 人工氣候箱、 高壓滅菌器、 Bag Mixer 400 型均質(zhì)機(jī)、 生物安全柜、 HWS-100G 型恒溫恒濕箱、 移液槍、 生化培養(yǎng)箱、 三維V 型混料機(jī)等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 益生菌配方粉的生產(chǎn)工藝

采用干混法向嬰幼兒配方奶粉中添加益生菌，各菌種以現(xiàn)有的生產(chǎn)工藝生產(chǎn)并檢測各個(gè)生產(chǎn)階段益生菌的存活數(shù)量， 每份做2 個(gè)平行樣， 益生菌配方粉的生產(chǎn)工藝為：

預(yù)混料（ 添加益生菌預(yù)混時(shí)間為15 min） →混料（混合攪拌時(shí)間為10 min） →裝罐→貯藏。

1.3.2 加速溫度的確定

以菌種a（ 動物雙歧桿菌Bb-12） 作為預(yù)試驗(yàn)的菌種， 將其與基粉和營養(yǎng)素混合后灌裝， 然后分別置于4 個(gè)溫度下（25， 37， 44， 55 ℃） 進(jìn)行加速試驗(yàn)， 試驗(yàn)過程中通過檢測4 個(gè)溫度下樣品里的活菌數(shù)樣品來確定加速試驗(yàn)過程中的最適溫度。

1.3.3 不同益生菌穩(wěn)定性的確定

分別向基粉（ 一段、 二段、 三段的奶粉） 中添加菌種a、 菌種b、 菌種c， 混合均勻置于37 ℃的條件下儲存2 個(gè)月后測定其活菌數(shù)， 分析在最適加速溫度的條件下， 探討保存時(shí)間對益生菌在嬰幼兒配方奶粉中的穩(wěn)定性。 試驗(yàn)過程中樣品中活菌數(shù)通過GB 78935—2010 中的方法來確定。

2 結(jié)果與分析

2.1 最適加速溫度的確定

溫度是益生菌嬰幼兒配方乳粉中各個(gè)環(huán)節(jié)需要控制的因素之一， 包括了生產(chǎn)、 運(yùn)輸、 貯藏和食用過程。 溫度主要是通過影響益生菌的活性來影響其生長繁殖， 溫度過高或過低都會影響益生菌生長。有研究人員發(fā)現(xiàn)， 乳酸菌很難在37 ℃溫度下正常生長， 且在高溫下其活菌數(shù)降低至添加時(shí)的20%左右。有研究人員研究溫度對益生菌的影響， 發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌能夠在45 ℃左右的高溫下生長繁殖。

益生菌加速試驗(yàn)是指在益生菌產(chǎn)品中其他營養(yǎng)素成分不衰減的情況下， 通過強(qiáng)化溫度試驗(yàn)條件，使樣品中的益生菌加速失效， 從而能在比較短的時(shí)間里得出益生菌在嬰幼兒配方奶粉中的穩(wěn)定性， 以便評估益生菌在正常條件下的可靠性或壽命指標(biāo)。以菌種a（ 動物雙歧桿菌Bb-12） 作為添加菌種， 在加速溫度分別為25， 37， 44， 55 ℃的條件下研究加速溫度對益生菌在奶粉中的影響， 測定不同溫度體系下的活菌數(shù)。

55 ℃加速試驗(yàn)下菌種a 的活菌量見圖1， 44 ℃加速試驗(yàn)下菌種a 的活菌量見圖2， 37 ℃加速試驗(yàn)下菌種a 的活菌量見圖3， 25 ℃加速試驗(yàn)下菌種a的活菌量見圖4。

圖2 44 ℃加速試驗(yàn)下菌種a 的活菌量

圖3 37 ℃加速試驗(yàn)下菌種a 的活菌量

圖4 25 ℃加速試驗(yàn)下菌種a 的活菌量

由圖1 可知， 在55 ℃的加速溫度下， 活菌數(shù)迅速降低， 在第2 天時(shí)活菌數(shù)由添加的1.5×108g-1已經(jīng)下降至小于50 g-1， 由于菌種活性隨溫度的升高不斷下降直至死亡， 所以55 ℃不宜作為加速試驗(yàn)的加速溫度。

由圖2 可知， 益生菌在44 ℃的加速溫度下活菌數(shù)下降迅速， 其下降幅度沒有55 ℃時(shí)大， 在加速試驗(yàn)的第2 天活菌量已經(jīng)降低至3.0×107g-1， 但44 ℃的加速溫度不利于比較菌種間的穩(wěn)定性， 不能設(shè)定為加速試驗(yàn)的加速溫度。

由圖3 可知， 在37 ℃的加速條件下， 益生菌的活菌數(shù)由第1 天的1.5×108g-1下降至第40 天的4.0×107g-1。 在40 d 內(nèi)益生菌的活菌數(shù)出現(xiàn)明顯下降的趨勢， 同時(shí)符合加速試驗(yàn)的相關(guān)要求， 有利于后續(xù)菌種間穩(wěn)定性比較試驗(yàn)。

由圖4 可知， 25 ℃下活菌數(shù)變化的趨勢不明顯，在長時(shí)間內(nèi)活菌數(shù)沒有明顯的下降， 8 d 內(nèi)， 活菌數(shù)由1.5×108g-1下降至1.4×108g-1。 此溫度不符合加速試驗(yàn)的目的， 在短時(shí)間內(nèi)不能分析不同菌種在嬰幼兒配方奶粉中的穩(wěn)定性。

綜上可知， 在37℃下進(jìn)行加速試驗(yàn)較為適宜，試驗(yàn)時(shí)間不會過長且能明顯看出菌種的衰減， 有利于快速測定菌種的穩(wěn)定性。

2.2 不同益生菌在嬰幼兒配方奶粉中穩(wěn)定性變化

2.2.1 菌種a（動物雙歧桿菌Bb- 12） 的穩(wěn)定性

在37 ℃的加速試驗(yàn)條件下， 測定添加菌種a 的嬰幼兒配方奶粉2 個(gè)月內(nèi)的活菌變化量。

37 ℃加速試驗(yàn)條件下菌種a 的活菌數(shù)見圖5。

圖5 37 ℃加速試驗(yàn)條件下菌種a 的活菌數(shù)

由圖5 可知， 每段奶粉的活菌數(shù)在儲存期間都呈現(xiàn)出下降趨勢， 在初期下降較為快速， 隨后緩慢下降， 但三段奶粉的活菌數(shù)在保存期間表現(xiàn)出不同的變化。 在10 d 內(nèi)， 一段奶粉中的菌種a 的活菌量由添加時(shí)的5.5×108g-1降低為4.3×108g-1， 隨后緩慢降至第60 天的3.93×108g-1； 二段奶粉的活菌量在10 d 內(nèi)降到了4.2×108g-1， 較一段奶粉下降較為明顯， 在隨后的加速試驗(yàn)中， 呈現(xiàn)出緩慢下降的趨勢， 在第60 天時(shí)， 活菌數(shù)已降低至3.52×108g-1； 三段奶粉在保存期活菌數(shù)下降更為明顯， 10 d 內(nèi)就下降至4.01×108g-1， 在第60 天時(shí)降低至3.02×108g-1，不同段的奶粉表現(xiàn)出明顯的差異， 說明菌種a 對水分較為敏感， 總體來說菌種a 的穩(wěn)定性較好， 可作為備選菌種添加在水分含量較少的乳粉中。

2.2.2 菌種b（動物雙歧桿菌Bi- 07） 的穩(wěn)定性

在37 ℃的加速試驗(yàn)條件下， 測定添加菌種b 的嬰幼兒配方奶粉2 個(gè)月內(nèi)的活菌變化量。

37 ℃加速試驗(yàn)條件下菌種b 的活菌數(shù)見圖6。

圖6 37 ℃加速試驗(yàn)條件下菌種b 的活菌數(shù)

由圖6 可知， 每段奶粉在37 ℃條件下進(jìn)行加速試驗(yàn)時(shí)， 10 d 內(nèi)活菌量出現(xiàn)明顯降低。 一段奶粉中菌種b 的添加量在10 d 內(nèi)由3.5×108g-1降低至2.8×108g-1， 隨后活菌數(shù)一直處于平緩下降的趨勢，儲存60 d 時(shí)活菌數(shù)也達(dá)到2.47×108g-1， 說明菌種b有較好的穩(wěn)定性； 二段奶粉中菌種b 的活菌數(shù)在10 d內(nèi)由3.5×108g-1降低至2.71×108g-1， 相比于一段奶粉， 下降幅度要大些， 但保存60 d 時(shí)， 兩段的活菌數(shù)基本處于一致的狀態(tài)； 三段奶粉的活菌數(shù)下降量明顯大于一段、 二段奶粉， 在第60 天時(shí)， 活菌數(shù)降低至 2.31×108g-1， 其主要原因是奶粉中水分含量的不同， 水分越多越不利于保持菌種的穩(wěn)定性， 而三段奶粉中的水分質(zhì)量明顯高于其他兩段。 綜上可知， 菌種b 在奶粉中保持著良好的穩(wěn)定性。

2.2.3 菌種c 的穩(wěn)定性

在37 ℃的加速試驗(yàn)條件下， 測定添加菌種c 的嬰幼兒配方奶粉2 個(gè)月內(nèi)的活菌變化量。

37 ℃加速試驗(yàn)條件下菌種c 的活菌數(shù)見圖7。

圖7 37 ℃加速試驗(yàn)條件下菌種c 的活菌數(shù)

由圖7 可知， 三段不同的奶粉在保存的前10 d內(nèi)活菌數(shù)都呈現(xiàn)出迅速下降的趨勢， 一段、 二段活菌數(shù)量由添加的3.9×108g-1降低到1.82×108g-1和1.78×108g-1， 三段奶粉則降低至1.42×108g-1。 在后期保存過程中， 一段、 二段下降趨勢基本一致， 在第60 天時(shí)， 下降到1.2×108g-1左右， 而三段奶粉中的活菌量降低到9.79×107g-1， 比一段、 二段奶粉中的益生菌下降快， 這種現(xiàn)象說明外界環(huán)境對菌種c 的影響較大， 失活快， 但后期還是較為穩(wěn)定， 因此建議加大添加量投入到奶粉中， 但也要考慮到成本問題。

3 結(jié)論

研究了3 種益生菌對嬰幼兒配方乳粉的穩(wěn)定性，得出以下結(jié)論：

（1） 加速試驗(yàn)的最適溫度為37 ℃， 因?yàn)樵摐囟认碌脑囼?yàn)時(shí)間不會過長， 同時(shí)能明顯看出活菌量的下降， 有利于比較菌株間的穩(wěn)定性。

（2） 益生菌的穩(wěn)定性試驗(yàn)表明， 在37 ℃的加速溫度下， 菌種b 的穩(wěn)定性最好， 在加速試驗(yàn)中存放2 個(gè)月活菌數(shù)也達(dá)到2.47×108g-1； 其次較為穩(wěn)定的是菌種a， 而菌種c 如果能加大投產(chǎn)量也可以作為添加到奶粉中的備選菌株。