擺倩文， 馬石霞， 馬咸瑩， 丁功濤， 陳士恩

（1. 西北民族大學 生物醫(yī)學研究中心中國- 馬來西亞國家聯(lián)合實驗室， 甘肅 蘭州 730030；2. 西北民族大學 生命科學與工程學院， 甘肅 蘭州 730030）

馬鈴薯（Solanum tuberosum L.） ， 茄科茄屬一年生草本， 又名土豆、 洋芋、 洋番薯等， 是世界上僅次于小麥、 水稻和玉米的第四大重要糧食作物[1]。2018 年我國馬鈴薯產(chǎn)量達1 798 萬t， 其深加工產(chǎn)品主要是馬鈴薯淀粉、 馬鈴薯全粉和休閑食品， 每年約有400 萬t 作為原料生產(chǎn)馬鈴薯淀粉[2]。 馬鈴薯淀粉加工會產(chǎn)生大量廢水， 廢水中蛋白含量較高。 目前， 這類馬鈴薯蛋白沒有得到有效的回收利用， 而是作為工藝廢水排放后進入生化處理池進行廢水處理，如果將廢水中的蛋白質進行回收并高值化利用， 馬鈴薯蛋白還能產(chǎn)生一定的經(jīng)濟效益， 同時能有效降低廢水中的有機物含量， 為后續(xù)的污水處理降低難度[3-4]。

馬鈴薯蛋白作為馬鈴薯淀粉加工的副產(chǎn)物， 是一類高營養(yǎng)價值的天然高分子， 由19 種氨基酸組成， 必需氨基酸含量為20.13%， 占氨基酸總量的47.9%， 其中色氨酸含量32 mg/100 g， 賴氨酸含量高達93 mg/100 g， 遠高于各類蛋白[5]。 其氨基酸組成均衡， 營養(yǎng)價值接近卵清蛋白， 具有重要的保健生理功能[6-7]。

以馬鈴薯蛋白為原料， 通過篩酶試驗， 選擇水解度最高的蛋白酶且以該水解條件進行酶解試驗，為馬鈴薯蛋白進一步開發(fā)應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

馬鈴薯蛋白， 陜西斯諾特生物技術有限公司提供； 堿性蛋白酶、 中性蛋白酶、 木瓜蛋白酶、 復合蛋白酶、 風味蛋白酶， 山東隆科特酶制劑公司提供；氫氧化鈉、 鹽酸等， 均為分析純； Gly-Gly-Tyr-Arg四肽標準品。

1.2 儀器

MS-H280-Pro 型數(shù)顯加熱磁力攪拌器， 北京開源國創(chuàng)科技有限公司產(chǎn)品； 水浴鍋、 臺式離心機、PB-10 型精密pH 計， Sartorius 公司產(chǎn)品； MP-500B型電子天平， 上海天平總廠產(chǎn)品； BIO-DL 型移液器， 上海沃元科技有限公司產(chǎn)品； 凱氏定氮儀， 丹麥福斯公司產(chǎn)品； 電泳儀， 美國BIO-RAD 產(chǎn)品； 高效液相色譜儀， 美國Agilent 產(chǎn)品； 紫外分光光度計，北京海鑫瑞科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 篩酶試驗

配制8%的馬鈴薯蛋白質溶液， 調節(jié)pH 值至酶的最適pH 值， 按一定質量比分別加入蛋白酶， 在各酶最佳的溫度條件下水解相同的時間， 計算并比較各酶的水解度， 篩選出水解度最高的酶。

5 種酶最佳反應條件見表1。

1.3.2 馬鈴薯蛋白水解物的制備

根據(jù)篩酶試驗， 采用水解度最高的蛋白酶， 在溫度55 ℃， pH 值7.5， E/S 1∶6， 反應時間4 h 的條件下進行水解。 將馬鈴薯蛋白粉溶解于純水中，配制質量分數(shù)為8%， 調節(jié)最佳pH 值后按比例加入蛋白酶， 在適當溫度下進行水解， 達到水解時間后將溫度調至85 ℃， 水浴滅活蛋白酶15 min。 經(jīng)離心超濾， 凍干保存。

1.3.3 馬鈴薯蛋白水解物的理化性質檢測

（ 1） SDS-PAGE 凝膠電泳。 采用SDS-PAGE 凝膠電泳的方法分析馬鈴薯蛋白水解物的分子量大小。配制12%分離膠， 混合均勻加入玻璃板； 樣品質量濃度按1 mg/mL 配制， 100 ℃下煮樣變性10 min，上樣量為20 μL。 80 V 電壓下低溫電泳2 h， 考馬斯亮藍染色之后脫色觀察。

（ 2） 高效液相檢測小分子量多肽。 色譜柱是Acquity Uplc Beh Sec 蛋 白 分 析 專 用 柱， 1.7 μm，4.6 mm×150 mm， 流動相為50 mmol/L K2HPO4和50 mmol/L KH2PO4， 流速0.3 mL/min， 于波長280 nm處測定分子量分布。

1.3.4 多肽含量的測定

取2.5 mL 樣品加入2.5 mL 10%的三氯乙酸， 混勻， 靜置10 min， 然后以轉速4 000 r/min 離心15 min，取上清到50 mL 離心管， 并用5%三氯乙酸定容至刻度， 搖勻。 取0.6 mL 上述溶液置另一試管， 加入雙縮脲試劑4 mL， 混勻， 靜置10 min， 以轉速2 000 r/min離心10 min， 取上清液于波長540nm 處測定OD 值，對照標準曲線求得樣品中多肽質量濃度C（mg/mL） ，進而求得多肽含量。

2 結果與分析

2.1 篩酶結果

按5 種酶的最佳水解條件， 對馬鈴薯蛋白進行水解， 其中風味蛋白酶的水解度最高， 達29.98%，其次是復合蛋白酶， 達29.28%， 其余3 種酶水解度均低于20%。

不同蛋白酶的水解效果見圖1。

酶與底物的結合具有特異性， 酶種類不同， 其水解效率也不同。 酶水解法是通過酶催化蛋白質分子中肽鏈（ 酰胺鍵） 斷裂， 生成肽鏈長度較短的肽分子或游離氨基酸[8]， 酶水解法的酶解位點特定， 可以有選擇性地水解某些蛋白一級結構特定的氨基酸肽鍵[9-10]。 水解度越高， 水解效果越好， 水解的肽段和氨基酸越多。 結合試驗結果， 風味蛋白酶的水解度最高。 因此， 將風味蛋白酶選作為目標酶進行馬鈴薯蛋白水解。

2.2 分子量分布

2.2.1 SDS- PAGE 凝膠電泳

SDS-PAGE 凝膠電泳檢測結果見圖2。

圖2 SDS-PAGE 凝膠電泳檢測結果

由圖2 可知， 將不同質量濃度的待測樣品進行凝膠電泳， 馬鈴薯蛋白未水解之前， 蛋白分子量主條帶分布在72， 34 kD 附近和大于17 kD 處， 經(jīng)過充分酶解之后馬鈴薯蛋白水解被水解成多種小分子物質， 分子量分布在17～34 kD， 且在質量濃度為20 μg/mL 時蛋白條帶較為明顯。 因此， 馬鈴薯蛋白水解液中的馬鈴薯蛋白已被充分水解且分子量小于17 kD。 凝膠電泳結果表明風味蛋白酶酶解馬鈴薯蛋白效率較高。

2.2.2 高效液相

按1.3.4（2） 中所述色譜條件， 通過HPLC 檢測分析馬鈴薯蛋白水解物中肽段分子量大小及所占百分比。

5 kD PH 高效液相色譜圖譜見圖3。

圖3 5 kD PH 高效液相色譜圖譜

由圖3 可知， PH 共6 個洗脫峰， Peak1 保留時間5.18～5.213 min， 分子量大小為43 067 D， 所占百分比0.325%； Peak2 保留時間6.28～6.50 min， 分子量大小為6 691 D， 所占百分比23.152%； Peak3 保留時間6.50～7.24 min， 分子量大小為968 D， 所占百分比44.15%； Peak4 保留時間7.24～7.753 min， 分子量大小為79 D， 所占百分比7.304%； Peak5 保留時間7.753～8.953 min， 分子量大小為5 D， 所占百分比24.271%； Peak6 保留時間9.607～10.067 min， 分子量大小為1 D， 所占百分比0.798%。 其中， 分子量為968 D 的Peak2 組分是占比最高的組分。

5～10 kD PH 高效液相色譜圖譜見圖4。

由圖4 可知， PH 共7 個洗脫峰， Peak1 保留時間4.493～5.180 min， 分子量大小為55 441 D， 所占百分比0.852%； Peak2 保留時間5.18～6.56 min， 分子量大小為6 579 D， 所占百分比43.066%； Peak3 保留時間6.56～6.96 min， 分子量大小為1 013 D， 所占百分比22.104%； Peak4 保留時間6.96～7.207 min，分子量大小為346 D， 所占百分比9.505%； Peak5 保留時間7.207～7.760 min， 分子量大小為105 D， 所占百分比9.308%； Peak6 保留時間7.760～9.380 min，分子量大小為5 D， 所占百分比22.328%； Peak7 保留時間9.380～10.260 min， 分子量大小為1 D， 所占百分比1.838%。 其中， 分子量為6 579 D 的Peak2組分是占比最高的組分。

10～30 kD PH 高效液相色譜圖譜見圖5。

圖5 10～30 kD PH 高效液相色譜圖譜

由圖5 可知， PH 共6 個洗脫峰， Peak1 保留時間4.853～5.227 min， 分子量大小為40 074 D， 所占百分比0.716%； Peak2 保留時間5.227～6.527 min，分子量大小為8 172 D， 所占百分比33.288%； Peak3保留時間6.56～6.96 min， 分子量大小為893 D， 所占百分比42.383%； Peak4 保留時間6.527～7.260 min，分子量大小為76 D， 所占百分比5.315%； Peak5 保留時間7.260～7.773 min， 分子量大小為105 D， 所占百分比9.308%； Peak6 保留時間7.773～8.62 min， 分子量大小為5 D， 所占百分比16.492%； Peak7 保留時間9.393～10.087 min， 分子量大小為1 D， 所占百分比1.807%。 其中， 分子量為893 D 的Peak3 組分是占比最高的組分。

30 kD PH 高效液相色譜圖譜見圖6。

圖6 30 kD PH 高效液相色譜圖譜

由圖6 可知， PH 共6 個洗脫峰， Peak1 保留時間4.493～5.073 min， 分子量大小為62 257 D， 所占百分比0.292%； Peak2 保留時間5.073～6.460 min，分子量大小為7 450 D， 所占百分比21.609%； Peak3保留時間6.460～7.247min， 分子量大小為990 D， 所占百分比49.561%； Peak4 保留時間6.527～7.260 min，分子量大小為76 D， 所占百分比5.315%； Peak5 保留時間7.260～7.747 min， 分子量大小為80 D， 所占百分比6.466%； Peak6 保留時間9.573～10.173 min，分子量大小為1 D， 所占百分比0.766%。 其中， 分子量為990 D 的Peak3 組分是占比最高的組分。

綜上所述， 馬鈴薯蛋白經(jīng)風味蛋白酶水解后得到的水解產(chǎn)物中， 不同分子量大小的組分中， 小分子物質所占百分比大， 由于經(jīng)過蛋白酶的充分酶解，大分子物質含量較少。

2.3 多肽含量

2.3.1 標準曲線的制作

取10 個15 mL 離心管， 用5% 的TCA 依次配制0， 0.2， 0.4， 0.6， 0.8， 1.0， 1.2， 1.4， 1.6， 1.8 mg/mL的Gly-Gly-Tyr-Arg 四肽標準溶液， 然后分別取6.0 mL 標準溶液， 加入4.0 mL 雙縮脲試劑， 于漩渦混合儀上混合均勻， 靜置10 min， 以轉速2 000 r/min離心10 min， 取上清液于波長540 nm 處測定OD 值（ 以第一管做空白對照）[11]。 以肽的質量濃度為橫坐標X， OD 值為縱坐標Y， 制作標準曲線， 得到回歸方程Y=0.048 1X-0.004 7， R2=0.990 4。

Gly-Gly-Tyr-Arg 四肽標準曲線見圖7。

圖7 Gly-Gly-Tyr-Arg 四肽標準曲線

2.3.2 馬鈴薯蛋白水解物中的多肽含量

比較蛋白水解物多肽分布情況見表2。

表2 比較蛋白水解物多肽分布情況

有研究報道[12-13]， 酪蛋白通過堿性蛋白酶水解后的產(chǎn)物中以1～5 kD 的肽段為主， 占83.5%±5.1%；小于1 kD 的占74%±5.5%； 大于5 kD 的只有16.7%±1.6%。

由表2 可知， 馬鈴薯蛋白和酪蛋白多肽含量相近。 馬鈴薯蛋白水解物中谷氨酸含量高達13.74%，是酪蛋白的3～11 倍， 谷氨酸參與蛋白質[14]， 多肽及脂肪酸的合成， 在細胞生長代謝其重要作用， 其中多肽又是蛋白質水解的中間產(chǎn)物， 且是經(jīng)過水解之后得到的水解物中不含有大分子量的蛋白質， 均在10 kD左右。 馬鈴薯蛋白經(jīng)過酶解， 得到的分子量均小于10 kD， 說明該蛋白的酶解產(chǎn)物主要為小分子肽類。

3 結論

以馬鈴薯蛋白為原料（83.7%） ， 選用風味蛋白酶進行水解， 比較了中性蛋白酶、 堿性蛋白酶、 木瓜蛋白酶、 風味蛋白酶和復合蛋白酶酶解之后的水解度， 選擇風味蛋白酶作為目標酶進行水解， 研究了其水解條件得到的水解產(chǎn)物的理化性質。 通過分子量分布與多肽含量分析， 得到馬鈴薯蛋白水解物分子量大小基本小于5～10 kD， 在小于5 kD 的多肽中， 占比最高的組分分子量為986 D， 占比44.15%；5～10 kD 中分子量占比最高的組分分子量為6 579 D，占比43.06%。 說明馬鈴薯蛋白經(jīng)過充分酶解， 得到的酶解產(chǎn)物中大分子物質含量較少， 大部分為小分子肽段， 表明水解效果較好， 基于該水解條件的工藝方法有效可行。