摘要：本文通過優(yōu)化實驗步驟、精簡操作環(huán)節(jié)、巧用實驗裝置、可視實驗結(jié)果、創(chuàng)新數(shù)據(jù)分析等對PCR擴增DNA片段及凝膠電泳鑒定實驗進行優(yōu)化。實驗改進能更好地優(yōu)化課堂教學(xué)結(jié)構(gòu)，幫助學(xué)生建立科學(xué)探究的基本方法，提升實驗數(shù)據(jù)的分析能力，從而有效提升學(xué)生的生物學(xué)學(xué)科核心素養(yǎng)。

關(guān)鍵詞：PCR;凝膠電泳；內(nèi)參照；人類SRY基因

文章編號：1003-7586（2024）02-0062-03 中圖分類號：G633.91 文獻標識碼：B

“PCR擴增DNA片段及凝膠電泳鑒定”實驗是浙科版普通高中教科書《生物學(xué)·選擇性必修3·生物技術(shù)與工程》（以下簡稱“教材”）第4章第1節(jié)內(nèi)容，本實驗是基于學(xué)生對DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)及半保留復(fù)制過程等模塊知識的延伸和實踐應(yīng)用。實際教學(xué)中常因?qū)嶒灢襟E繁瑣、實驗耗時長、對教師操作要求高等原因，使得實驗“開展率”較低。為了突破教學(xué)難點，對本實驗進行改進和優(yōu)化，通過優(yōu)化實驗步驟、精簡操作環(huán)節(jié)、創(chuàng)新實驗裝置、可視實驗結(jié)果、巧用數(shù)據(jù)分析等，讓學(xué)生更好地體會生物學(xué)學(xué)科的實用性，在解決實際問題的過程中激發(fā)學(xué)生對生命科學(xué)的熱愛。

1 教材實驗問題

本活動包含“PCR擴增DNA片段”和“瓊脂糖凝膠電泳與鑒定”兩個實驗。在實際操作過程中存在以下問題：實驗耗時長，PCR擴增、制膠、電泳、染色和脫色等步驟至少需3h；實驗缺少對照導(dǎo)致結(jié)果不夠嚴謹；條帶大小判斷較主觀，對DNA Marker條帶利用不充分；靜置脫色較慢，實驗效率較低；凝膠背景模糊。同時，教材中實驗以驗證性實驗的形式呈現(xiàn)，留給學(xué)生主動思考和探究的內(nèi)容較少?；谝陨显?，對本實驗進行改進和優(yōu)化，以提升實驗的可操作性和科學(xué)性。

2 實驗操作過程

2.1 實驗原理

SRY基因是啟動男性睪丸發(fā)育的主要基因。人類SRY基因位于Y染色體短臂Yp11.3，僅含一個外顯子，無內(nèi)含子。本實驗選擇人類基因組為模板進行PCR擴增，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）基因為內(nèi)參照。結(jié)果同時擴增出SRY和GAPDH基因條帶，為男性樣品，僅有GAPDH基因條帶，則為女性樣品。

2.2 實驗器材

PCR儀、無菌PCR管、移液槍、電泳儀、電泳槽、凝膠槽、離心機、EP管、細胞裂解液、瓊脂粉、電泳緩沖液、無水酒精、亞甲基藍、上樣緩沖液、DNA Marker5000、蛋白酶K緩沖液、TE緩沖液，引物如表1所示。

2.3 口腔上皮細胞基因組粗提取

實驗前選取興趣小組男女生志愿者各一名，用生理鹽水漱口1 min。將漱口水轉(zhuǎn)移至離心管中，13 000轉(zhuǎn)離心1 min，棄上清液。每個離心管內(nèi)分別加入200 μL細胞裂解液和50 μL蛋白酶K吹打混勻。13 000轉(zhuǎn)離心1 min，上清液轉(zhuǎn)移至無菌離心管，加入400 μL無菌水放人-20℃冰箱保存。

2.4 PCR擴增DNA片段

實驗前隱去基因組性別標記，用“甲”和“乙”代替。學(xué)生四人一組，每人取兩支無菌PCR管，分別用于擴增SRY和GAPDH基因片段，每人擴增模板需取自同一性別樣品。為方便結(jié)果對比，組內(nèi)兩人取“甲”為模板，另兩人取“乙”為模板。向無菌PCR管中依次加入模板、引物、Taq酶等試劑，最后將全班的PCR管放人PCR儀中，按圖1設(shè)定反應(yīng)程序進行擴增。

2.5 凝膠電泳及染色觀察

制膠：稱取瓊脂粉1.0 g，加到盛有100 mL電泳緩沖液的三角瓶中。用封口膜封緊，微波爐加熱至充分溶解，倒入凝膠槽并立即插上膠梳。冷凝后輕拔膠梳，取出凝膠置于電泳槽內(nèi)，上樣孔靠近負極側(cè)，往電泳槽內(nèi)加入電泳緩沖液，使之剛好沒過凝膠。

上樣：PCR擴增實驗完成后取出PCR反應(yīng)管，每管加入10 μL上樣緩沖液，吹打混勻。每塊凝膠的第一個上樣孔內(nèi)加入20 μL DNA Marker 5000，其余上樣孔依次加入20 μL樣品。

電泳：連接好電泳儀電極，蓋好電泳槽蓋，恒壓150V條件下電泳18 min。

染色：電泳結(jié)束后，將凝膠轉(zhuǎn)移至濃度0.1%亞甲基藍染液中，染液沒過凝膠，染色8 min。

脫色：取出凝膠，加入75%酒精脫色1.5 min;倒去酒精；加入蒸餾水放置搖床中脫色至出現(xiàn)藍色條帶，觀察并分析實驗結(jié)果，并在組內(nèi)、組間交流討論。

3 實驗改進與優(yōu)化

3.1 縮短實驗時間，提高實驗效率

本實驗開出率較低，主要是因為實驗耗時較長。浙科版新版教材選擇擴增酵母菌的某基因片段，其長度長達841 bp，整個實驗流程下來至少需4個課時，課程安排較為困難。實驗改進后選擇擴增人類SRY和GAPDH部分基因，長度分別為239 bp和554bp。變性、退火、延伸時長均從1min縮短至30 s，預(yù)熱和終延伸時長縮短至3 min。興趣小組在預(yù)實驗時對比30輪和33輪循環(huán)擴增結(jié)果發(fā)現(xiàn)無明顯差異，故循環(huán)減少至30輪。以上改進從整體上縮短了實驗時間，同時也提升了實驗的可操作性。

3.2 引入內(nèi)參照，確保實驗科學(xué)性

對照原則是中學(xué)生物學(xué)實驗設(shè)計中最常用的原則，引入對照組能使實驗更為科學(xué)嚴謹。實驗前，教師布置相關(guān)問題：為何還要同時擴增GAPDH基因片段？能否僅根據(jù)SRY基因片段進行性別判定？學(xué)生討論得知人為操作因素會影響實驗結(jié)果，不能僅參照SRY基因片段，所以引入內(nèi)參照對實驗來說至關(guān)重要。本次實驗引入GAPDH基因作為內(nèi)參照，GAPDH基因男女性均有，為管家基因（Housekeeping），序列高度保守，幾乎在所有組織中呈高水平、恒定表達，常用作蛋白質(zhì)、RNA、DNA等分子生物學(xué)相關(guān)實驗的標準化內(nèi)參照。實驗中每個學(xué)生都完成兩個PCR反應(yīng)體系，從某小組實驗結(jié)果（見圖2A）明顯能看出“A1號”和“A4號”為“男性”樣品；“A2號”和“A3號”為“女性”樣品，該小組成員都擴增出GAPDH基因片段，說明本組操作較為規(guī)范。

3.3 合并樣品上樣，增強實驗現(xiàn)象

預(yù)實驗中學(xué)生常因移液槍使用不夠熟悉，易將上樣孔戳穿導(dǎo)致樣品外溢，再次上樣時發(fā)現(xiàn)上樣孔“不夠用”，重新制膠又需較長時間。如果SRY和GAPDH基因擴增產(chǎn)物上樣到不同泳道，則會導(dǎo)致實驗現(xiàn)象不夠直觀。針對以上問題，教師提問：能否將不同基因片段合并混勻后加入到同一上樣孔中？電泳時不同基因片段是否會相互干擾？學(xué)生根據(jù)所學(xué)知識討論得出：影響電泳的主要因素是基因片段長度、形狀和所帶電荷數(shù)，不同基因片段混合后電泳不會相互影響，電泳是分離基因片段的常用方法。本次改進既節(jié)約上樣孔，又使得實驗現(xiàn)象更直觀，能直接對同一泳道中兩個條帶進行觀察比較（見圖2B）。

3.4 建構(gòu)數(shù)學(xué)模型，表征實驗結(jié)果

觀察條帶時，學(xué)生主要通過比對臨近Marker條帶的大小，粗略估算出條帶長度。教師提問：①如果DNA條帶位于兩條Marker條帶中間，如何準確計算其長度？②實驗中有8個Marker條帶，多數(shù)學(xué)生僅用到兩條條帶，其他條帶是否蘊含有重要信息？③已知DNA片段長度的對數(shù)值與電泳遷移距離呈負相關(guān)，能否利用構(gòu)建數(shù)學(xué)模型的方法準確計算片段長度？在分析討論以上問題后，組內(nèi)學(xué)生測量上樣孔與各Marker條帶的距離，即遷移距離，計算全班的數(shù)值平均值計入表2。

運用Excel軟件對Marker遷移距離和片段長度的對數(shù)值進行散點圖繪制，選中“散點”并添加“趨勢線”獲得如圖3所示曲線。結(jié)果顯示R2值達到0．9939，說明趨勢線與數(shù)據(jù)的擬合度較好。將目的條帶遷移距離代入公式換算，得出片段長度分別約為250bp和549 bp，與實際長度239 bp和554 bp較為接近。以上改進既克服了片段估算的盲目性，使實驗更加嚴謹，又提升了學(xué)生構(gòu)建數(shù)學(xué)模型的能力。

3.5 巧用實驗器材，提升實驗效果

因儀器設(shè)備限制，鼓勵學(xué)生充分利用現(xiàn)有設(shè)備提升實驗效果。如在觀察染色結(jié)果時，凝膠中殘留亞甲基藍且凝膠厚度不均導(dǎo)致背景較深，從而影響觀察和拍照效果。學(xué)生提議將凝膠放置于更為平整的臺燈面上方，手動調(diào)整臺燈亮度，使得條帶更為清晰干凈（見圖4）。脫色處理時，教材建議將凝膠放入蒸餾水中靜置脫色。預(yù)實驗時對比靜置脫色和搖床轉(zhuǎn)動脫色的效果，結(jié)果顯示搖床中脫色使得條帶更加清晰，并且可通過調(diào)節(jié)搖床轉(zhuǎn)速和溫度提升脫色效率。

4 實驗小結(jié)

通過優(yōu)化和改進實驗步驟，有效解決了教材中實驗操作耗時長、實驗現(xiàn)象不明顯、實驗結(jié)果不理想等問題，避免了因?qū)嶒灢怀晒Χ档蛯W(xué)生學(xué)習(xí)積極性的情況。根據(jù)實驗情況及時調(diào)整實驗步驟，如“口腔上皮細胞基因組粗提取”實驗可在課前完成，將基因組凍存于-20℃冰箱，PCR擴增和凝膠電泳及觀察可在“連堂課”完成，其中PCR擴增時長約45 min。在等待PCR擴增的過程中，可配制電泳緩沖液、亞甲基藍染液和凝膠等。此外，由于本活動中需手動測量DNA遷移距離，導(dǎo)致測距誤差較大，可以匯總?cè)鄶?shù)據(jù)取平均值以減小實驗誤差。

實驗教學(xué)不僅是生物學(xué)課程的特點，更是促成學(xué)生達成生物學(xué)學(xué)科核心素養(yǎng)的重要支撐，本實驗過程中教師需要有效組織學(xué)生合作交流，發(fā)展科學(xué)思維，培養(yǎng)質(zhì)疑精神，提升創(chuàng)新能力。

基金項目：2022年度浙江省教師教育規(guī)劃課題“基于課程綜合化的高中生物學(xué)情景教學(xué)與實踐”（ZX2022041）。