吳秀儀, 黃 和, 曹湛慧, 伍 櫻, 黃君梅, 程舒婕, 陳泳恩
( 廣東海洋大學 食品科技學院, 廣東 湛江 524088)
可可( Cacao) , 原產(chǎn)于美洲熱帶的常綠喬木,屬梧桐科, 在赤道南北緯10 °以內(nèi)的熱帶地區(qū)廣泛種植, 與咖啡、 茶葉一起并稱為世界三大軟飲料??煽傻墓麑崬榭煽啥?, 是巧克力生產(chǎn)的主要原材料,廣泛應用于甜點、 飲料、 乳制品、 糖果等食品行業(yè),其濃郁芳香的獨特味道深受人們喜愛。 可可豆中主要活性物質(zhì)為多酚類化合物( 占5%~15%) 、 生物堿(主要為可可堿和咖啡堿, 占3%~6%)、 礦物質(zhì)( 如K、 Ca、 Mg 等)、 維A、 維B、 維E 等。
可可堿(Theobromine; 化學式: 3,7- 二氫-3,7-二甲基-1H- 嘌呤-2,6- 二酮) 是可可中含量最多的生物堿, 含量約為1.5%。 目前, 可可堿主要應用于臨床效用, 現(xiàn)有相關文獻表明, 己酮可可堿有治療短暫性腦缺血癥狀、 增強精子活力、 輔助治療糖尿病[1-2]等功效。 此外, 有關可可堿的其他生物活性和實際應用的報道較少見。
以可可豆為原料, 通過乙醇回流法提取可可堿粗提物, 采用大孔樹脂對粗提物進行純化, 研究可可堿粗提物及純化物的抗氧化活性。 從總還原能力及對3 種自由基( 二苯代苦味肼基自由基、 羥基自由基、 超氧陰離子自由基) 的清除能力評價可可堿的抗氧化能力, 進一步探索可可堿利用價值, 為可可堿的綜合利用提供科學依據(jù)。
可可豆, 采摘于海南興隆的中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院香飲研究所可可種植基地。
可可堿標準品, 上海安譜實驗科技股份有限公司提供, 純度99%; LS-303 型大孔吸附樹脂, 陜西藍深特種樹脂有限公司提供; 鹽酸、 三氯乙酸、 過氧化氫、 無水乙醇、 鐵氰化鉀、 水楊酸、 硫酸亞鐵、三羥甲基氨基甲烷、 焦性沒食子酸等, 均為分析純。
LC-20AD 型高效液相色譜儀, 日本島津公司產(chǎn)品; HH-6 型數(shù)顯恒溫水浴鍋, 國華電器有限公司產(chǎn)品; BT100-8 型數(shù)顯恒流泵, 上海青浦瀘西分析儀器廠產(chǎn)品; BS-100A 型電腦全自動部分收集器, 上海青浦瀘西分析儀器廠產(chǎn)品; RE-2000A 型旋轉蒸發(fā)儀, 上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品; 722 型可見光分光光度計, 上海儀電分析儀器有限公司產(chǎn)品。
1.3.1 可可豆預處理
將可可豆清洗干凈后剝殼取出果實, 將其烘干、粉碎, 過50 目篩, 得到可可粉, 于冰箱中4 ℃下避光保藏。
1.3.2 可可堿粗提物的提取
取適量可可豆粉, 利用乙醇回流法提取可可粉中的可可堿。 從料液比、 提取時間、 乙醇體積分數(shù)3 個方面設計單因素試驗, 得出乙醇回流法提取可可粉中的可可堿較佳的工藝條件為料液比1∶50, 提取時間60 min, 乙醇體積分數(shù)30%。 結合單因素試驗的結果進一步設計L9( 34)正交試驗, 通過極差分析、方差分析及最終的驗證試驗, 得出可可堿提取的最佳工藝條件為料液比1∶60, 提取時間60 min, 乙醇體積分數(shù)30%。 采用正交試驗得出的最佳工藝條件提取可可堿, 得到可可堿粗提物。
1.3.3 可可堿粗提物的純化
將提取出來的可可堿粗提物經(jīng)旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮后, 利用LS-303 型大孔樹脂純化可可堿粗提物。 首先, 對大孔樹脂進行預處理。 先用95%乙醇溶液浸泡樹脂24 h 去除其中雜質(zhì), 然后進行濕法裝柱, 繼續(xù)用95%乙醇淋洗, 直至洗出液變清澈且不出現(xiàn)白色渾濁, 最后用蒸餾水繼續(xù)淋洗至無明顯乙醇氣味。 參考楊軍國等人[3]富集咖啡堿的方法并加以改進, 準確稱取200 g 處理過的LS-303 型大孔樹脂( 濕重) , 濕法裝柱, 用蒸餾水平衡樹脂12 h, 使樹脂填充緊密, 不得出現(xiàn)氣泡與分層, 否則重新裝柱。取100 mL 經(jīng)旋轉蒸發(fā)濃縮后的可可堿粗提物溶液以1 mL/min 的吸附速度上柱。 待樹脂完全吸附飽和后,用20%乙醇溶液作為洗脫劑以1 mL/min 的流速進行可可堿的解吸附。 洗脫劑的上柱速度與洗脫液的流出速度相等。 每隔3 min 收集一次洗脫液, 每管體積為3 mL, 一共收集80 管。 通過高效液相色譜儀測定分析各小管中洗脫液的可可堿含量, 繪制動態(tài)洗脫曲線, 將可可堿含量較高的幾管合并, 作為最終純化物。 最終測得同體積下, 經(jīng)過大孔樹脂純化后的可可堿質(zhì)量濃度為純化前的3.31 倍。
1.3.4 可可堿含量的測定
取可可堿標準品用乙醇溶解配制成梯度質(zhì)量濃度的標準溶液, 用于制作標準曲線來確定樣品中可可堿含量。 利用高效液相色譜儀測定可可堿的含量,并記錄下不同質(zhì)量濃度的標準溶液的峰面積, 根據(jù)數(shù)據(jù)繪制得到可可堿標準曲線, 得到標準曲線的線性回歸方程和R2。
參考盧金清等人[4]建立的可可堿高效液相色譜(HPLC) 含量測定方法, 高效液相色譜儀器條件為:用型號為Agilent ZORBAX Extend-C18( 250 mm×4.6 mm, 5 μm) 的色譜柱, 以乙腈- 水( 體積分數(shù)為20%~80%) 作為流動相, 進行等度洗脫, 流速為0.8 mL/min, 檢測波長為275 nm, 柱溫為30 ℃。
將可可堿提取物以轉速3000 r/min 離心10 min,過濾, 將濾液轉至100 mL 容量瓶中以相對應的溶劑定容。 取5 份定容后的溶液分別用高效液相色譜儀測定提取物可可堿的含量。
1.3.5 抗氧化試驗
配制質(zhì)量濃度為0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mg/mL的可可堿粗提液及純化液( 以可可堿含量計) , 作為待測樣品溶液, 同理配制質(zhì)量濃度為0.2, 0.4, 0.6,0.8, 1.0 mg/mL 的維C 溶液( 以維C 含量計) 作為對照組, 同一條件下與待測樣品溶液共同進行抗氧化試驗, 每組試驗平行進行3 次, 結果取平均值。
(1) 總還原能力的測定。 參考文獻[5]的方法進行可可堿粗提液和純化液的總還原能力的測定。 于10 mL 比色管中加入不同濃度的樣品溶液1 mL、0.2 mol/L 的pH 值6.6 磷酸緩沖鹽溶液2.5 mL、 1%鐵氰化鉀溶液2.5 mL, 搖勻后于50 ℃恒溫水浴鍋中反應20 min, 冷卻后滴入10%三氯乙酸溶液2.5 mL 使反應終止, 將混合溶液置于離心機中以轉速3 000 r/min離心10 min, 另取干凈的比色管放入離心后的上清液2.5 mL、 0.1%三氯化鐵溶液0.5 mL、 蒸餾水2.5 mL,混合均勻后靜置反應10 min。 最后以蒸餾水為參照,于波長700 nm 處測定吸光度。 用吸光度的高低來衡量樣品溶液的還原性強弱, 吸光度越高, 樣品溶液的總還原能力越高。
(2) 二苯代苦味肼基自由基( DPPH·) 清除率的測定: 參考文獻[5]的方法測定可可堿粗提液及純化液的清除DPPH·自由基能力。 取3 mL 不同濃度的樣品溶液、 0.2 mmol/L 的DPPH 溶液3 mL 混合均勻, 于黑暗處避光反應30 min, 以無水乙醇為參照, 于波長512 nm 處測定吸光度Ai。 同時, 以樣品溶液3 mL 與無水乙醇混合液3 mL 作為本底組,測定其吸光度Aj, 排除樣品溶液本身顏色影響; 并取0.2 mmol/L 的DPPH 溶液3 mL 與無水乙醇混合液3 mL 作為空白組, 測定其吸光度A0。 以維C 為陽性對照, 樣品溶液對DPPH 自由基的清除率(R1)按下式計算。
( 3) 羥基自由基(·OH) 清除率的測定: 參考文獻[6]的方法測定可可堿粗提液及純化液的清除OH自由基能力。 于比色管中加入10 mmol/L 水楊酸- 乙醇溶液( 現(xiàn)配現(xiàn)用) 、 10 mmol/L 硫酸亞鐵溶液( 現(xiàn)配現(xiàn)用)、 樣品溶液各1 mL, 再加入0.03%過氧化氫溶液1 mL 啟動反應, 混勻后置于37 ℃水浴鍋中反應30 min, 最后將反應溶液于波長510 nm 處測定吸光度Ai。 同時, 取10 mmol/L 水楊酸- 乙醇溶液、10 mmol/L 硫酸亞鐵溶液、 待測樣品溶液、 無水乙醇各1 mL 混合均勻后測定吸光度值, 作為本底組吸光度Aj;并取10 mmol/L 水楊酸- 乙醇溶液、 10 mmol/L 硫酸亞鐵溶液、 蒸餾水、 0.03%過氧化氫溶液各1 mL 混合均勻后測定吸光度值, 作為空白組吸光度A0。 以維C為陽性對照, 樣品溶液對OH 自由基的清除率(R2)按下式計算。
(4) 超氧陰離子(O2-·) 自由基清除率的測定:參考文獻[7]的方法測定可可堿粗提液及純化液的清除O2-自由基能力。 于比色管中放入50 mmol/L的pH 值8.2 Tris-HCl 緩沖溶液4.5 mL、 樣品溶液1 mL, 置于25 ℃水浴鍋中保溫10 min, 滴入25 mmol/L 鄰苯三酚溶液0.3 mL( 現(xiàn)配現(xiàn)用) , 繼續(xù)于25 ℃中保溫5 min, 滴入1~2 滴濃鹽酸終止反應, 最后將反應溶液于波長325 nm 處測定吸光度Ai。 同時, 用蒸餾水1 mL 代替樣品溶液進行上述反應, 作為空白對照,測得吸光度A0。 以維C 為陽性對照, 樣品溶液對O2-自由基的清除率(R3)按下式計算。
1.3.6 試驗數(shù)據(jù)與處理
所有數(shù)據(jù)是3 次平行試驗結果的平均值, 數(shù)據(jù)均利用SPSS 軟件進行整理分析, 利用Origin 2017 軟件繪制圖表。
以梯度質(zhì)量濃度的可可堿標準品做出標準回歸曲線, 所得曲線方程為Y=21 926X+6 751.2, 相關系數(shù)R2=0.999 9, 具有較高的可信度。 據(jù)色譜圖可得,保留時間為6.45 min 時, 可可堿有特征吸收峰。
可可堿標準曲線見圖1, 可可堿標準品色譜圖見圖2。
圖1 可可堿標準曲線
圖2 可可堿標準品色譜圖
2.2.1 總還原力的比較
各樣品溶液總還原能力的比較見圖3。
圖3 各樣品溶液總還原能力的比較
該方法是基于氧化還原反應的比色法, 以樣品溶液對Fe3+的還原能力作為總還原能力。 由圖3 可知, 在0.2~1.0 mg/mL 的范圍內(nèi), 純化前后的可可堿及維C 的總還原能力均隨著質(zhì)量濃度的增大而增強。總體來說, 可可堿純化液的總還原能力比粗提液強。當可可堿純化液的質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL 時, 平均吸光度達到1.289, 同一質(zhì)量濃度下的維C 的平均吸光度為1.303, 二者十分接近, 說明可可堿純化液具有良好的總還原能力。 粗提液的總還原能力不及純化液和維C, 最大質(zhì)量濃度的粗提液的平均吸光度僅為0.999。
2.2.2 對1,1- 二苯基- 2- 苦肼基(DPPH·) 清除能力的比較
各樣品溶液對DPPH·清除能力的比較見圖4。
圖4 各樣品溶液對DPPH 清除能力的比較
DPPH·的乙醇溶液呈紫色, 且在特定波長下有強吸收。 抗氧化劑容易與DPPH·的孤對電子配對,從而造成DPPH·減弱或消失, 因此通過DPPH·的濃度變化可計算樣品對DPPH·的清除率。 利用SPSS 軟件, 對數(shù)據(jù)進行線性模擬, 計算出三者對DPPH·的半抑制濃度IC50用來比較三者清除DPPH·的能力。計算得出, 可可堿純化液的IC50為0.343, 粗提液為0.562, 維C 為0.23, 即三者對DPPH·的清除能力由高到低排序為維C>可可堿純化液>可可堿粗提液。 當質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL 時, 維C 的清除率達98.53%, 純化液的清除率達80.35%, 而粗提液僅為72.48%。 其中, 純化液的清除率與質(zhì)量濃度具有較好的線性關系, 說明其對DPPH·的清除能力較好。
2.2.3 對羥基自由基(·OH) 清除能力的比較
各樣品溶液對羥自由基清除能力的比較見圖5。
圖5 各樣品溶液對羥自由基清除能力的比較
利用Fenton 反應, 即H2O2與Fe2+混合反應生成·OH, 水楊酸能夠捕捉·OH 并產(chǎn)生有色物質(zhì), 該物質(zhì)在特定波長下有最大吸收, 根據(jù)樣品與水楊酸的競爭可計算出樣品的清除率。 計算得出, 維C、 可可堿純化液、 粗提液對羥自由基的半抑制濃度IC50值分別為0.231, 0.402, 0.652。 故三者對羥自由基的清除能力由高到低排序為維C >可可堿純化液>可可堿粗提液。 當質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL 時, 維C 的清除率達98.82%, 純化液的清除率達97.03%, 二者比較接近, 而粗提液僅為76.04%。
2.2.4 對超氧陰離子自由基(O2-·) 清除能力的比較
各樣品溶液對超氧陰離子清除能力的比較見圖6。
圖6 各樣品溶液對超氧陰離子清除能力的比較
在堿性條件下, 鄰苯三酚容易發(fā)生自氧化反應生成O2-·, 而O2-·是一種能夠促進鄰苯三酚自氧化的有色的中間產(chǎn)物, 因此測定樣品對其自氧化抑制作用即可測定對O2-·的清除能力。 計算得出維C、 可可堿純化液、 可可堿粗提液對超氧陰離子的半抑制濃度IC50分別為0.311, 0.458, 0.448。 因此, 維C 對超氧陰離子的清除能力強于可可堿粗提液及純化液, 而粗提液與純化液的清除能力較為相近。 當質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL 時, 維C 的清除率最高, 達到99.17%; 純化液達到89.62%, 粗提液達到80.99%。
通過乙醇回流法提取可可堿粗提物, 采用大孔樹脂對粗提物進行純化, 研究可可堿粗提物及純化物的抗氧化活性。 結果表明, 可可堿具有總還原能力及對3 種自由基清除能力。 當可可堿質(zhì)量濃度為0.2~1.0 mg/mL 時, 其自由基清除能力與可可堿濃度呈良好的線性關系, 其中可可堿對DPPH 自由基的清除能力最好( IC50為0.343) , 其次為羥基自由基(IC50為0.402) 和超氧陰離子自由基(IC50為0.458) 。因此, 可可堿具有較好的抗氧化活性, 可作為天然抗氧化劑使用。