李 騰，周小蘭，褚 靜，王立芹，曹國芬，張海苗

（西安醫(yī)學(xué)院護(hù)理學(xué)院，陜西西安 710021）

產(chǎn)后抑郁癥（postpartum depression,PPD）是產(chǎn)褥期女性出現(xiàn)的明顯抑郁癥狀，屬于產(chǎn)褥期精神綜合征之一。目前，藥物治療和心理治療是PPD最常用的兩種治療方法，但治療成功率低，效果不理想。因此，探索針對(duì)PPD的新療法至關(guān)重要。目前有研究表明，腸道微環(huán)境失調(diào)可能與焦慮、抑郁等心理疾病有關(guān)[1]。因此，腸道微生態(tài)與抑郁癥的關(guān)系也為PPD的治療提供了新思路。

益生菌(probiotics)是指足量服用時(shí)能對(duì)機(jī)體產(chǎn)生有益影響的、活的微生物。能夠改善行為和心理狀態(tài)的益生菌被稱為益心菌(psychobiotics)。鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus Rhamnus GG,LGG）屬于乳桿菌屬，多存在于人和動(dòng)物的腸道內(nèi)，與雙歧桿菌都屬于目前公認(rèn)的益心菌[2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)益心菌與抑郁樣行為和某些神經(jīng)遞質(zhì)釋放密切相關(guān)[3]。但國內(nèi)外少有研究報(bào)道鼠李糖乳桿菌與PPD之間關(guān)系。本研究采用地塞米松磷酸鈉建立PPD小鼠模型，初步研究鼠李糖乳桿菌通過調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)改善小鼠產(chǎn)后抑郁相關(guān)癥狀，從而為產(chǎn)后抑郁的研究和治療提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)成年C57BL/6雌雄小鼠各50只，體質(zhì)量18～24 g，購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物進(jìn)行為期1周的適應(yīng)性喂養(yǎng)，室溫（24～27）℃，濕度45%～50%，給予自然晝夜節(jié)律光照，動(dòng)物可自由攝食飲水。期間對(duì)雌性小鼠進(jìn)行24 h食物消耗實(shí)驗(yàn)、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、糖水消耗實(shí)驗(yàn)，以此獲得行為學(xué)實(shí)驗(yàn)的基線值。

1.2 動(dòng)物模型制備、分組及干預(yù)適應(yīng)性喂養(yǎng)結(jié)束后將雌雄小鼠按1∶1比例合籠交配，24 h后行陰道涂片檢測(cè)雌性小鼠是否懷孕。受孕雌鼠獨(dú)籠飼養(yǎng)，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為鼠李糖乳桿菌干預(yù)低劑量組（Ⅰ組，n=10）、鼠李糖乳桿菌干預(yù)高劑量組（Ⅱ組，n=10）、陽性對(duì)照組（Ⅲ組，n=10）、模型對(duì)照組（Ⅳ組，n=10）、空白對(duì)照組（Ⅴ組，n=10）。Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組和Ⅳ組小鼠自受孕第1天開始，皮下注射1 mL/(kg·d)生理鹽水，共注射14 d。受孕第15天開始，皮下注射0.2 mg/(kg·d)地塞米松磷酸鈉，直至23 d左右產(chǎn)崽。Ⅴ組小鼠孕期給予1 mL/(kg·d)的生理鹽水。產(chǎn)后通過灌胃給藥的方式進(jìn)行干預(yù)，Ⅰ組和Ⅱ組小鼠分別給予鼠李糖乳桿菌1×107和1×108CFU（kg·d），Ⅲ組小鼠給予1.8 mg/（kg·d）帕羅西汀，Ⅳ組和Ⅴ組小鼠給予等量的生理鹽水，干預(yù)時(shí)間為4周。

1.3 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)分別于造模前、造模結(jié)束及干預(yù)后進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)。

1.3.124 h食物消耗實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)開始前動(dòng)物需禁食禁水24 h，然后給予每只小鼠足量準(zhǔn)確稱量的普通飼料，24 h后稱量剩余飼料質(zhì)量，同時(shí)稱重動(dòng)物。計(jì)算24 h攝食量，公式：攝食量=(食物總量?食物余量)/體質(zhì)量×100%。記錄每周的體質(zhì)量變化，體質(zhì)量變化率=(本周體質(zhì)量?第1周體質(zhì)量)/本周體質(zhì)量。

1.3.2曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 曠場(chǎng)為40 cm×40 cm×40 cm的無蓋封閉區(qū)域。將小鼠放在曠場(chǎng)的一個(gè)角，軟件自動(dòng)記錄小鼠在開放場(chǎng)中30 min的自主運(yùn)動(dòng)情況，并從軟件中導(dǎo)出5 min和30 min小鼠運(yùn)動(dòng)的總距離以及在中心區(qū)域停留的時(shí)間和次數(shù)等參數(shù)。

1.3.3糖水消耗實(shí)驗(yàn) 適應(yīng)性喂養(yǎng)期間訓(xùn)練小鼠飲用糖水，并進(jìn)行第一次糖水消耗實(shí)驗(yàn)，獲得基線資料。具體方法：每只小鼠給予2個(gè)己分別稱重的水瓶，一瓶為純水，另一瓶為10 g/L蔗糖水，6 h后調(diào)換2個(gè)水瓶位置，第二天早晨5點(diǎn)取水瓶稱重，由稱重前后的差值計(jì)算糖水偏愛百分比。公式：糖水偏愛百分比（%）=糖水消耗/總液體消耗×100%。之后每周進(jìn)行1次，及時(shí)觀察其變化。

1.4 反相高效液相色譜法檢測(cè)小鼠前額葉5-HT、NE及DA的含量①各組小鼠于最后1次行為學(xué)檢測(cè)后，麻醉處死，冰上斷頭取腦組織，參照小鼠腦立體定位圖譜，冰上迅速分離前額葉組織，按質(zhì)量體積比1∶10加入組織緩沖勻漿液(生理鹽水)充分勻漿(冰上操作)，將組織勻漿液用吸管轉(zhuǎn)移至離心管中；3 000 r/min 4℃離心20 min；吸上清轉(zhuǎn)移至多個(gè)Eppendorf管中分裝，?80℃冰箱保存。②分別稱取5-HT、DA和NE標(biāo)準(zhǔn)品各0.5 mg，分別溶于0.5 mL超純水中，分裝后作為標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，置于?70℃冰箱避光保存。實(shí)驗(yàn)前用超純水稀釋成不同濃度，并以0.1 mol/L的高氯酸溶液作為蛋白沉淀混合工作液。③進(jìn)行反相高效液相色譜法分析：取腦組織勻漿液100μL，加入乙腈200μL渦旋混合20 s，15 000 r/min離心、取上清后于40℃水浴中氮?dú)獯蹈?，殘留物?00μL流動(dòng)相溶解，15 000 r/min離心、取上清20μL進(jìn)樣。④HPLC測(cè)定：色譜條件為色譜柱Cap cell pack Cis,150 mm×2.1 mm，5μm(USA)；流動(dòng)相為乙腈和水(1∶1)等度洗脫，0～3 min，流速為0.50 mL/min。63 mmol/L一水合檸檬酸、0.13 mmol/L EDTA、60 mL/L甲醇的混合液，pH 4.3；流速1.0 mL/min，柱溫25℃；進(jìn)樣量20μL；測(cè)定電極電勢(shì)?150 mV和400 mV。

1.5 RT-qPCR測(cè)定腸道菌群的變化于最后1次行為學(xué)檢測(cè)后麻醉處死，取出各組小鼠盲腸將其完整凍存于?80℃。應(yīng)用糞便DNA提取試劑盒從盲腸內(nèi)容物中提取DNA，純度在1.8～2.0，保存于?20℃。取糞腸球菌、雙歧桿菌、乳酸菌和大腸桿菌4種菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株凍干粉0.05 g，并溶于200μL PBS緩沖液，按試劑盒要求提取其DNA。各標(biāo)準(zhǔn)菌株依照瓊脂糖凝膠回收試劑盒操作進(jìn)行回收純化制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)系統(tǒng)軟件檢測(cè)的熒光值，自動(dòng)分析Ct值，生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)驗(yàn)中每個(gè)樣品做2個(gè)復(fù)孔，反應(yīng)條件同標(biāo)準(zhǔn)曲線，取樣本最后的平均Ct值進(jìn)行分析。引物設(shè)計(jì)參照相關(guān)文獻(xiàn)，應(yīng)用NCBI數(shù)據(jù)庫比對(duì)，篩選出特異性強(qiáng)的引物信息（表1），由上海生工生物工程公司合成。

表1 檢測(cè)盲腸中4種菌的RT-qPCR引物Tab.1 RT-qPCR test of the four types of bacteria in the cecum

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 造模前小鼠行為學(xué)評(píng)估各組小鼠造模前（飼喂適應(yīng)期）的攝食量、體質(zhì)量變化率、曠場(chǎng)移動(dòng)距離和速度、糖水消耗百分比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表2)。

表2 造模前各組小鼠行為學(xué)評(píng)估Tab.2 Behavioral evaluation of various mouse groups before molding （n=10）

2.2 造模后小鼠行為學(xué)評(píng)估造模結(jié)束后各組小鼠進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試。Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組和Ⅳ組組間比較，各行為學(xué)指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與Ⅴ組相比，其余組小鼠的攝食量和體質(zhì)量變化率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而曠場(chǎng)移動(dòng)距離、移動(dòng)速度和糖水偏愛百分比明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，表3）。這提示Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組和Ⅳ組小鼠抑郁樣行為較Ⅴ組明顯，造模成功。

表3 造模后各組小鼠行為學(xué)評(píng)估Tab.3 Behavioral evaluation of various mouse groups after molding (n=10）

2.3 鼠李糖乳桿菌干預(yù)后小鼠行為學(xué)評(píng)估鼠李糖乳桿菌干預(yù)后各組小鼠的攝食量沒有明顯變化。與Ⅴ組比較，Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組的曠場(chǎng)移動(dòng)距離和速度明顯增多，糖水偏愛百分比減少（P<0.05）。與Ⅳ組比較，Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組和Ⅴ組的體質(zhì)量變化率、曠場(chǎng)移動(dòng)距離和速度、糖水偏愛百分比顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示Ⅳ組小鼠的抑郁樣行為較Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組更明顯（表4）。

表4 干預(yù)后各組小鼠行為學(xué)評(píng)估Tab.4 Behavioral evaluation of mice in different groups after intervention （n=10）

2.4 反相高效液相色譜法檢測(cè)結(jié)果各組小鼠前額葉區(qū)單胺神經(jīng)遞質(zhì)(5-HT、DA、NE)總體上差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與Ⅴ組比較，Ⅳ組小鼠前額葉區(qū)單胺神經(jīng)遞質(zhì)均減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與Ⅳ組比較，Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組小鼠前額葉區(qū)單胺神經(jīng)遞質(zhì)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與Ⅰ組、Ⅱ組相比，Ⅲ組小鼠前額葉區(qū)5-HT、DA和NE增高，但差異不明顯，Ⅰ組和Ⅱ組組間比較，小鼠前額葉區(qū)單胺類遞質(zhì)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，表5）。

表5 各組小鼠前額葉區(qū)單胺神經(jīng)遞質(zhì)濃度Tab.5 Monoamine neurotransmitter concentration in the mouse prefrontal region (±s，ng/mL，n=10)

表5 各組小鼠前額葉區(qū)單胺神經(jīng)遞質(zhì)濃度Tab.5 Monoamine neurotransmitter concentration in the mouse prefrontal region (±s，ng/mL，n=10)

與Ⅴ組比較，*P<0.05；與Ⅳ組比較，#P<0.05。

組別Ⅰ組Ⅱ組Ⅲ組Ⅳ組Ⅴ組F P 5-HT 152±33.41#153±27.86#154±17.52#150±12.76*160±19.45 34.871 0.002 NE 208±25.72#206±23.64#210±37.48#192±17.44*210±26.63 77.225 0.002 DA 110±47.03#111.80±36.92#112.60±38.47#97±26.82*110.43±18.06 100.219 0.001

2.5 腸道菌群RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果與Ⅴ組比較，PPD建模后小鼠盲腸中糞腸球菌、大腸桿菌和乳酸桿菌顯著增加(P<0.05)，而雙歧桿菌有所減少，但未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與Ⅳ組比較，干預(yù)后糞腸球菌、大腸桿菌和乳酸桿菌均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，雙歧桿菌有上升趨勢(shì)，但未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組各組間比較，小鼠各菌群差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，表6）。

表6 各組小鼠腸道菌群RT-PCR檢測(cè)的Ct值比較Tab.6 Detection of CT value by RT-PCR of intestinal flora in the mice （±s，n=10）

表6 各組小鼠腸道菌群RT-PCR檢測(cè)的Ct值比較Tab.6 Detection of CT value by RT-PCR of intestinal flora in the mice （±s，n=10）

與Ⅴ組比較，*P<0.05；與Ⅳ組比較，#P<0.05。

組別Ⅰ組Ⅱ組Ⅲ組Ⅳ組Ⅴ組F P糞腸球菌2.56±0.51#2.53±0.37#2.55±0.72#3.48±0.45*2.51±0.35 6.350 0.030大腸桿菌6.55±0.43#6.59±0.32#6.55±0.46#6.87±0.41*6.54±0.38 5.814 0.010雙歧桿菌4.29±0.33 4.30±0.32 4.32±0.66 3.81±0.40 4.44±0.43 3.832 0.068乳酸桿菌7.43±0.21#7.42±0.50#7.40±0.37#8.20±0.43*7.24±0.33 5.420 0.010

3 討 論

以往的產(chǎn)后抑郁動(dòng)物模型建立多采用生理性刺激（束縛、電擊、禁食禁水）、激素停撤模型等（雌性小鼠卵巢去勢(shì)；外源性注射雌激素、孕激素，突然停撤激素模擬產(chǎn)后抑郁狀態(tài)），但外源性的刺激或手術(shù)創(chuàng)傷與臨床PPD的發(fā)病原因和臨床表現(xiàn)有一定差距，造成模型不穩(wěn)定。近年來，有學(xué)者發(fā)展轉(zhuǎn)基因抑郁動(dòng)物模型（Wistar Kyoto大鼠和Flinder Resistant Line大鼠）[4]，這類產(chǎn)后抑郁模型雖然較穩(wěn)定，但又難以獲得。GREGUS等[5]通過長期反復(fù)高劑量地塞米松磷酸鈉注射，成功誘導(dǎo)出產(chǎn)后抑郁動(dòng)物模型。本研究根據(jù)GREGUS等的研究設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示各組小鼠造模前行為基本一致，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；造模結(jié)束后各組小鼠進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試，Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組和Ⅳ組組間比較，各行為學(xué)指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與Ⅴ組比較，其余組小鼠的曠場(chǎng)移動(dòng)距離、移動(dòng)速度和糖水偏愛百分比明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表示Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組和Ⅳ組小鼠抑郁樣行為較Ⅴ組明顯，與GREGUS等結(jié)果一致，造模成功。

體質(zhì)量增長情況能從宏觀上反映小鼠的抑郁狀態(tài)。鼠李糖乳桿菌的干預(yù)能減緩小鼠產(chǎn)后體質(zhì)量增長率的下降，干預(yù)后Ⅰ組和Ⅲ組小鼠的體質(zhì)量增長率較Ⅳ組顯著上升，可能與體質(zhì)量本身變化不穩(wěn)定性有關(guān)。而24 h攝食量變化較平穩(wěn)，呈整體下降趨勢(shì)，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能該評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)PPD動(dòng)物模型不太敏感。

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)主要反映小鼠在陌生環(huán)境的自發(fā)探究和自主運(yùn)動(dòng)能力[6]。本研究結(jié)果顯示，鼠李糖乳桿菌能提高產(chǎn)后抑郁小鼠在曠場(chǎng)中的移動(dòng)總距離和速度，增加產(chǎn)后抑郁小鼠的探索能力。糖水消耗是反映抑郁小鼠快感缺乏的重要指標(biāo)[7]。本研究結(jié)果顯示，Ⅳ組小鼠的純水消耗量持續(xù)上升，糖水消耗量持續(xù)下降，表明該模型組小鼠出現(xiàn)了抑郁癥的核心癥狀。相比之下，Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組小鼠的純水消耗量先上升后降低，而糖水消耗量先降低后升高。干預(yù)后，與Ⅳ組比較，Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組小鼠的純水消耗量下降，糖水消耗量和糖水偏愛百分比增加，表明鼠李糖乳桿菌增加產(chǎn)后抑郁小鼠的欣快感以及對(duì)蔗糖的偏愛程度。

單胺類神經(jīng)遞質(zhì)在HPA軸、應(yīng)激刺激和情緒障礙中起著重要作用，神經(jīng)遞質(zhì)代謝水平失衡會(huì)導(dǎo)致患者精神活動(dòng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的異常[8]。前額葉是大腦中最重要的區(qū)域之一，有著廣泛的神經(jīng)聯(lián)系，同時(shí)也是情緒通路的重要環(huán)節(jié)[9]。臨床實(shí)驗(yàn)表明，前額葉受損與多種精神類疾病有關(guān)[10]。機(jī)體精神的紊亂可引起前額葉神經(jīng)元的損傷，導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)的傳導(dǎo)和釋放受到影響。本研究結(jié)果顯示，與Ⅴ組比較，Ⅳ組小鼠前額葉區(qū)單胺神經(jīng)遞質(zhì)濃度均減少，表明Ⅳ組小鼠前額葉區(qū)的單胺類神經(jīng)系統(tǒng)功能減退。與Ⅳ組比較，Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組小鼠前額葉區(qū)單胺神經(jīng)遞質(zhì)濃度增加，表明Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組通過提高前額葉區(qū)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)濃度，起到抗抑郁作用。Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組組間比較，小鼠前額葉區(qū)5-HT、DA和NE濃度無明顯變化，表明鼠李糖乳桿菌和帕羅西汀有類似的抗抑郁效果。

隨著神經(jīng)科學(xué)技術(shù)的飛速進(jìn)步，越來越多的研究開始將腸道微生物群與大腦的神經(jīng)反應(yīng)通過多種雙向途徑(微生物群-腸-腦軸)聯(lián)系起來，并取得了很大進(jìn)展[11]。研究表明，益生菌干預(yù)后能夠調(diào)節(jié)大鼠腸道菌群，修復(fù)炎性組織損傷，逆轉(zhuǎn)應(yīng)激后腸道通透性的增加，抑制HPA軸的高反應(yīng)性[12-13]。腸道微生物可能通過“腸腦軸”影響宿主的情緒、行為，甚至認(rèn)知功能，還能與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)代謝物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，更加表明益生菌對(duì)精神異常疾病的重要影響，也為腸道菌群與PPD的研究開辟了新的方向。本研究結(jié)果顯示，PPD建模后小鼠盲腸中糞腸球菌、大腸桿菌和乳酸桿菌顯著增加，雙歧桿菌有所減少，而鼠李糖乳桿菌干預(yù)后能逆轉(zhuǎn)腸道菌群的變化，其可能通過調(diào)節(jié)腸道菌群促使小鼠抑郁樣行為得到改善。Ⅰ組和Ⅱ組小鼠各指標(biāo)比較差異不明顯，提示鼠李糖乳桿菌的低劑量和高劑量對(duì)各指標(biāo)的影響差異不大。

綜上，本研究結(jié)果提示，鼠李糖乳桿菌通過調(diào)節(jié)腸道菌群、影響單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，改善小鼠抑郁樣行為，但具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步探索，這也是本課題組未來研究的方向。