王 亞，韓克陽(yáng)，李 文，王韶瀾，瞿蓉蓉，劉 源，孫貝貝，姜 靜，吳衛(wèi)東

（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003）

近年來(lái)，隨著工業(yè)化、城鎮(zhèn)化和交通運(yùn)輸業(yè)的快速發(fā)展，地表臭氧(ozone，O3)污染有逐年加重趨勢(shì)，特別是在一些人口密集的大城市，已引起人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注[1]。O3可單獨(dú)或（和）顆粒物等其他污染物成分產(chǎn)生交互作用，加重對(duì)人體健康的損害[2]。大量流行病學(xué)研究結(jié)果表明，O3暴露與心血管和呼吸系統(tǒng)發(fā)病率[3-4]、住院率及死亡率增加[5-8]，以及不良妊娠結(jié)局相關(guān)[9-12]。近年來(lái)，O3對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響受到重視[13-14]。一項(xiàng)病例交叉研究發(fā)現(xiàn)，腦卒中事件前2～3 d，O3水平每上升10μg/m3，腦卒中風(fēng)險(xiǎn)上升3%[15]。室外空氣污染可促進(jìn)老年人神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展，成為威脅人類健康的重要因素[16-17]。然而，目前O3所致神經(jīng)損傷或退行性病變的機(jī)制研究較少。因此，本研究通過(guò)模擬現(xiàn)實(shí)生活臭氧暴露來(lái)探究其對(duì)雄性小鼠的神經(jīng)退行性病變影響及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)裝置及動(dòng)物本研究的臭氧暴露倉(cāng)由團(tuán)隊(duì)自主研發(fā)，暴露劑量1 mg/m3是從嚙齒類動(dòng)物推斷到靈長(zhǎng)類動(dòng)物暴露濃度的3倍劑量。在空氣污染嚴(yán)重地區(qū)，O3濃度可達(dá)到0.2～0.3 mg/m3，因而在嚙齒類動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，暴露劑量1 mg/m3被認(rèn)為是與污染較重地區(qū)人群暴露等效[18]。健康SPF級(jí)7～8月齡C57BL/6N雄性小鼠23只，體質(zhì)量28～36 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供(動(dòng)物合格證號(hào)：20200916Abzz0619000350)。動(dòng)物使用和程序按照新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)的規(guī)定和要求進(jìn)行。所有飼養(yǎng)條件均依據(jù)盡量減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物痛苦和使用動(dòng)物數(shù)量的原則執(zhí)行。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及飼養(yǎng)條件小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3周后，隨機(jī)分為對(duì)照組(空氣組11只)和臭氧組(1 mg/m3，4 h/d，12只)。分籠飼養(yǎng)，12 h/12 h晝夜交替，飼養(yǎng)溫度(24±2)℃，相對(duì)濕度40%～60%，自由進(jìn)食、飲水，每周至少更換1次墊料。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的制作臭氧裝置由本課題組自主研發(fā)，由臭氧發(fā)生裝置和暴露倉(cāng)組成(圖1)。暴露倉(cāng)分臭氧箱和清潔空氣箱，暴露艙內(nèi)的溫度和濕度與小鼠的飼養(yǎng)環(huán)境一致，采用呼吸道染毒的方法，暴露過(guò)程中不提供食物和墊料。臭氧濃度為1 mg/m3，1次/d，4 h/次，連續(xù)染毒8周。對(duì)照組與臭氧組分別同時(shí)放在暴露倉(cāng)內(nèi)，除臭氧濃度以外，其他條件均一致。

1.4 主要實(shí)驗(yàn)儀器與試劑北京諾達(dá)思Morris水迷宮視頻跟蹤分析系統(tǒng)，Agilent Bioanalyzer 2100凝膠成像分析系統(tǒng)。Tau、p-Tau和α-synuclein兔源一抗(1∶1 000)購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technology公司，內(nèi)參β-Actin和羊抗兔標(biāo)記二抗購(gòu)自英國(guó)Affinty公司。

1.5 標(biāo)本采集及指標(biāo)檢測(cè)方法染毒8周后，所有小鼠均進(jìn)行Morris水迷宮試驗(yàn)，6 d后，腹腔注射烏拉坦麻醉，斷頭取腦，用濾紙吸干水分，電子天平稱濕重，計(jì)算大腦臟器系數(shù)，分離雙側(cè)海馬組織及腦皮層組織。用內(nèi)固定方法分離腦組織，40 g/L多聚甲醛后固定，蘇木素-伊紅(HE)染色，測(cè)定大鼠海馬組織中病理改變，免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腦皮層中Tau、p-Tau和α-synclein蛋白的表達(dá)。

1.5.1Morris水迷宮試驗(yàn) 第1～第5天為定位航行試驗(yàn)，4次/d，水下安全平臺(tái)置于第3象限固定位置不變。隨機(jī)選4個(gè)象限的中央作為入水點(diǎn)，將小鼠面向池壁放入水中，每個(gè)入水點(diǎn)不重復(fù)。每次實(shí)驗(yàn)60 s，當(dāng)小鼠爬上平臺(tái)并在平臺(tái)上逗留5 s，記錄小鼠找到平臺(tái)所需的時(shí)間，即為逃避潛伏期，電腦記錄隨即停止。如果小鼠在60 s內(nèi)未找到平臺(tái)，將其逃避潛伏期記為60 s，之后由實(shí)驗(yàn)者引導(dǎo)小鼠找到水下安全平臺(tái)，并讓其在平臺(tái)上停留15 s，使小鼠觀察水迷宮四周環(huán)境，幫助小鼠記憶。在試驗(yàn)第6天進(jìn)行空間探索試驗(yàn)，撤走水下安全平臺(tái)，從平臺(tái)所在直徑的遠(yuǎn)端入水點(diǎn)將小鼠放入水中，測(cè)試其60 s內(nèi)，跨越原平臺(tái)所在位置的次數(shù)。

1.5.2HE染色 小鼠全身內(nèi)固定，腦組織后固定,石蠟包埋,切片，厚度為4μm,60℃烘箱內(nèi)烤片,切片常規(guī)脫蠟處理,蘇木素染色4 min,伊紅染液中染色5 min,脫水透明,中性樹(shù)膠封片,干燥，光學(xué)顯微鏡下觀察，并采集圖像。

1.5.3免疫印跡實(shí)驗(yàn) 取適量腦皮層組織；RIPA細(xì)胞裂解液提取蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度；蛋白樣本上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳后；轉(zhuǎn)膜至PDVF膜上，室溫封閉1 h；敷一抗(Tau、p-Tau和α-synuclein的稀釋比例為1∶1 000)4℃過(guò)夜；次日TBST洗膜3遍；加二抗(1∶10 000)室溫孵育1 h；TBST洗膜3遍；化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，采集圖像，保存膠片，使用Image J分析目的條帶灰度值，用對(duì)應(yīng)β-Actin條帶進(jìn)行灰度值校正。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用Graphpad 5.0和SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組內(nèi)逃避潛伏期比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 動(dòng)物的一般情況暴露過(guò)程中臭氧組小鼠偶有情緒不穩(wěn)，表現(xiàn)為亂撞亂咬籠壁。暴露結(jié)束時(shí)對(duì)照組和臭氧組小鼠均精神狀態(tài)良好，皮毛光滑，緊貼皮膚，攝食飲水及活動(dòng)正常。

2.2 水迷宮試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1定位航行試驗(yàn) 水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)在水迷宮訓(xùn)練的1～5 d進(jìn)行。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行重復(fù)測(cè)量方差分析，結(jié)果顯示，數(shù)據(jù)符合Mauchly球形檢驗(yàn)(P<0.001)，Greenhouse-Geisser結(jié)果顯示，時(shí)間效應(yīng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=13.141，P<0.001)，且時(shí)間與組別之間的交互作用無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.084，P=0.967)，即各組小鼠的逃避潛伏期均隨時(shí)間的增加而明顯縮短，且兩組的下降趨勢(shì)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表1，圖2）。

表1 小鼠定位航行實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期Tab.1 Evaded incubation periods of the mice’s positioning navigation experiments (s)

兩組小鼠在第1天游泳時(shí)無(wú)目的性，對(duì)安全平臺(tái)的感知較差，隨著訓(xùn)練天數(shù)延長(zhǎng)，兩組小鼠均表現(xiàn)出一定的學(xué)習(xí)記憶能力。與空氣組相比，O3組小鼠學(xué)習(xí)并準(zhǔn)確記住安全平臺(tái)位置的能力稍減弱，第5天差別較顯著。第6天定位航行實(shí)驗(yàn)中，兩組小鼠均可穿過(guò)安全平臺(tái)，與空氣組相比，臭氧組小鼠穿過(guò)安全平臺(tái)的次數(shù)略低（圖3）。

圖3 兩組小鼠空間探索實(shí)驗(yàn)典型軌跡圖Fig.3 A typical trajectory map of the two groups of mice’s space exploration experiments

2.2.2空間探索試驗(yàn) Morris水迷宮試驗(yàn)第1～第5天訓(xùn)練完成后,第6天撤去平臺(tái)，兩組小鼠穿越原平臺(tái)次數(shù)結(jié)果顯示，臭氧組穿越平臺(tái)次數(shù)[（2.00±1.66）次]略低于對(duì)照組[（2.43±1.27）次]，兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 臭氧暴露對(duì)小鼠體質(zhì)量及腦系數(shù)的影響暴露前后臭氧組小鼠體質(zhì)量與對(duì)照組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。臭氧組暴露前后增加量與空氣組相比略微下降，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。大腦臟器系數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。

表2 O3組和空氣組暴露前后小鼠體質(zhì)量、腦質(zhì)量及腦/體比Tab.2 Weight,brain weight and brain/body ratio in the mice before and after exposure in O 3 and air groups （±s）

表2 O3組和空氣組暴露前后小鼠體質(zhì)量、腦質(zhì)量及腦/體比Tab.2 Weight,brain weight and brain/body ratio in the mice before and after exposure in O 3 and air groups （±s）

組別空氣組O 3組動(dòng)物數(shù)(只)11 12暴露前體質(zhì)量(g)33.37±2.65 34.09±1.25暴露后體質(zhì)量(g)33.97±2.06 34.59±1.63腦質(zhì)量(g)0.33±0.01 0.34±0.01腦/體(%)9.24±0.67 9.62±0.41

2.4 臭氧暴露對(duì)海馬病理學(xué)的影響根據(jù)細(xì)胞形態(tài)不同，小鼠海馬可分為海馬回和齒狀回(dentategyrus,DG)2個(gè)部分，其中海馬回主要由錐體神經(jīng)元組成，分為CA 1、CA 2、CA 3，DG區(qū)由顆粒細(xì)胞組成（圖4）。與空氣組相比，O3組小鼠的CA 3區(qū)有一定程度損傷，細(xì)胞排列稍紊亂，核固縮，伊紅染色較深等，由于新生期細(xì)胞質(zhì)對(duì)伊紅著色較淡，提示O3組CA 3區(qū)細(xì)胞衰老或發(fā)生退行性變（圖5）。

圖4 海馬結(jié)構(gòu)分區(qū)Fig.4 Hippocampal structure partition（×50）

圖5 O 3暴露對(duì)海馬區(qū)的影響Fig.5 Effects of O3 exposure on the hippocampus region

2.5 臭氧暴露對(duì)腦皮層組織Tau、p-Tau和α-Synuclein蛋白表達(dá)的影響本研究利用Western blotting進(jìn)一步檢測(cè)O3暴露對(duì)神經(jīng)退行性病變相關(guān)蛋白的影響。與空氣組比較，O3組小鼠p-Tau及α-synuclein表達(dá)量均升高(P<0.05)。兩組小鼠皮層Tau蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖6）。

圖6 小鼠大腦皮層組織Tau、p-tau、α-synuclein蛋白表達(dá)水平Fig.6 T au,p-tau,andα-synuclein protein expression levels in the mice’s cerebral cortex tissues

與空氣組相比，O3組小鼠皮質(zhì)中p-Tau（P=0.003 5)和α-synuclein(P=0.039 4)蛋白表達(dá)水平顯著升高，Tau表達(dá)量?jī)山M間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖7）。

圖7 小鼠皮質(zhì)p-Tau、Tau、α-Synuclein蛋白相對(duì)表達(dá)水平Fig.7 Relative expression levels of the mice’s cortical p-Tau,Tau,andα-synuclein proteins

3 討 論

長(zhǎng)期以來(lái)，O3污染一直是全世界城市和工業(yè)區(qū)中的主要環(huán)境問(wèn)題。在過(guò)去30年中，隨著我國(guó)化石燃料消耗量的迅速增加，O3前體物(氮氧化物和揮發(fā)性有機(jī)化合物)排放量也隨之急劇增加(超過(guò)了北美和歐洲)[19-20]，引發(fā)了對(duì)日益惡化的O3污染的擔(dān)憂[19,21]。以往的研究和控制環(huán)境污染的措施主要將酸雨、顆粒物以及細(xì)顆粒物(PM2.5)列為優(yōu)先事項(xiàng)，對(duì)O3污染研究甚少，部分原因是缺乏對(duì)大氣O3及其前體的監(jiān)測(cè)。WANG等[22]2019年報(bào)道在中國(guó)北方、長(zhǎng)江、珠江三角洲和四川盆地等地區(qū)，O3取代PM2.5成為首要污染物，高O3濃度污染頻繁發(fā)生。廣泛分布在對(duì)流層的O3，對(duì)地表生物，如莊稼、植被，尤其是人類健康均可產(chǎn)生有害效應(yīng)[1]。由于O3的危害日益明顯，國(guó)際上對(duì)于O3的安全標(biāo)準(zhǔn)制定得越來(lái)越嚴(yán)格[23]。

關(guān)于O3對(duì)健康影響的研究對(duì)象大多以自然人群為主，也有研究發(fā)現(xiàn)老年人、婦女、兒童以及心肺疾病患者在O3暴露下健康風(fēng)險(xiǎn)較大，然而針對(duì)老年人、兒童、肺部疾病患者等敏感人群的研究較少[24-25]。同時(shí)，老年人既是O3污染的敏感人群，也是神經(jīng)退行性病變的易感人群，我國(guó)人口老齡化日趨加重，關(guān)注老年人精神健康問(wèn)題，科學(xué)養(yǎng)老成為公共衛(wèi)生的工作重心[26]。本研究重點(diǎn)就O3暴露對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷及其潛在機(jī)制進(jìn)行探究。

在行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中，Morris水迷宮試驗(yàn)評(píng)估學(xué)習(xí)記憶功能較為常見(jiàn)，學(xué)習(xí)記憶受損是認(rèn)知功能障礙中常見(jiàn)的一種表現(xiàn)[26]。Morris水迷宮試驗(yàn)前5 d為定位航行實(shí)驗(yàn)，通過(guò)變換入水象限和重復(fù)訓(xùn)練鍛煉動(dòng)物記憶環(huán)境標(biāo)志物來(lái)找到水下隱匿的平臺(tái)；第6天的空間探索實(shí)驗(yàn)撤去水下平臺(tái)，根據(jù)動(dòng)物穿過(guò)平臺(tái)所在位置的次數(shù)及在平臺(tái)所在象限停留的時(shí)間等指標(biāo)來(lái)評(píng)估動(dòng)物空間學(xué)習(xí)的能力。本研究定位航行實(shí)驗(yàn)中，兩組小鼠逃避潛伏期均隨著學(xué)習(xí)天數(shù)的增加而縮短，說(shuō)明各組小鼠均有一定的學(xué)習(xí)記憶能力。其中，臭氧組小鼠的逃避潛伏期下降趨勢(shì)緩于空氣組，各天逃避潛伏期較空氣組均有延長(zhǎng)，表明暴露O3對(duì)小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力有潛在損傷。

學(xué)習(xí)記憶能力降低是中樞神經(jīng)退行性病變的重要表現(xiàn)。為了探討O3影響小鼠學(xué)習(xí)記憶能力減退的可能機(jī)制，本研究進(jìn)一步探究O3暴露對(duì)神經(jīng)退行性病變經(jīng)典調(diào)控蛋白(Tau蛋白和α-synuclein)的影響。Tau是一種存在于大腦的額葉、顳葉、海馬及內(nèi)嗅區(qū)神經(jīng)元中的微管相關(guān)蛋白，具有促進(jìn)微管的組裝和調(diào)節(jié)微管的穩(wěn)定性作用，從而來(lái)維持細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)軸突轉(zhuǎn)運(yùn)等[27]。在結(jié)構(gòu)上，Tau是天然未折疊的蛋白質(zhì)，具有高度可溶性并且?guī)缀鯖](méi)有聚集傾向，而在神經(jīng)退行性疾病中可見(jiàn)到Tau的聚集的異常纏結(jié)，常被認(rèn)為是神經(jīng)退行性病變的病理特征之一[28-30]。正常人腦內(nèi)Tau蛋白的磷酸化維持在一個(gè)較低的水平，當(dāng)腦內(nèi)氧化應(yīng)激水平增加時(shí)，會(huì)導(dǎo)致Tau出現(xiàn)代償性的磷酸化水平增高[29,31]。本研究發(fā)現(xiàn)，與空氣組相比，1 mg/m3O3暴露8周的小鼠皮質(zhì)中Tau的表達(dá)量無(wú)明顯差異，但p-Tau表達(dá)量顯著增加，這可能是由于O3可引起腦內(nèi)的氧化應(yīng)激水平增加[29]，進(jìn)而促進(jìn)Tau的磷酸化[32]。

α-synuclein作為路易體(Lewy body)的重要組成成分，是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸前表達(dá)的可溶性蛋白質(zhì)[32]。參與維持各種突觸正常功能，α-synuclein在神經(jīng)元內(nèi)的異常聚集與多種神經(jīng)退行性疾病關(guān)系密切[33-34]。臨床研究顯示，α-synuclein低聚物有誘導(dǎo)Tau蛋白低聚物形成的作用，兩者相互協(xié)同，最終形成纖維淀粉樣結(jié)構(gòu)。阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)患者淀粉樣斑塊中存在α-synuclein，可與細(xì)胞外Aβ共同促進(jìn)淀粉樣斑塊沉積[35]。與空氣組相比，O3組小鼠腦皮質(zhì)中出現(xiàn)α-synuclein蛋白表達(dá)顯著增高，提示O3組小鼠可能出現(xiàn)一些與神經(jīng)退行性疾病相關(guān)的神經(jīng)元損傷。

綜上所述，臭氧暴露引起學(xué)習(xí)記憶力能力出現(xiàn)下降趨勢(shì)，可能與腦皮層p-Tau和α-synuclein蛋白表達(dá)增加及海馬組織神經(jīng)元病理?yè)p傷有關(guān)。