張慧敏，劉曉旭，謝佩玲，陳和燕，何建軍，王 珂

（西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院乳腺外科，陜西西安 710061）

血管新生是包括乳腺癌在內(nèi)的許多惡性腫瘤的特征之一[1]。與正常組織的血管不同，實(shí)體瘤的血管不僅生長活躍、結(jié)構(gòu)紊亂，且大多數(shù)為無功能血管，而這種結(jié)構(gòu)和功能的異常會(huì)導(dǎo)致瘤內(nèi)缺氧，引起腫瘤生物學(xué)行為的進(jìn)一步惡化。雖然基礎(chǔ)研究結(jié)果證實(shí)血管新生對(duì)于乳腺癌的生長和轉(zhuǎn)移是必須的，提示抗血管生成治療可使患者受益，然而多項(xiàng)臨床研究的結(jié)果卻不盡如人意[2]。因此，積極探尋其他抑制血管新生的方法迫在眉睫。

青藤堿是從青藤的根莖中提取的生物堿單體，臨床常用其鹽酸鹽（鹽酸青藤堿）治療風(fēng)濕及類風(fēng)濕性疾病。青藤堿的藥理學(xué)作用廣泛，包括抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗血管新生、抗心律失常以及輕微的鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛作用。近年來的研究還發(fā)現(xiàn)，青藤堿對(duì)肝癌、胃癌、乳腺癌、骨肉瘤等腫瘤細(xì)胞均具有抑制增殖、阻滯細(xì)胞周期和誘導(dǎo)凋亡的作用[3-7]。

在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的研究中已證實(shí)，青藤堿可以通過抑制HIF-1α-VEGF-ANG-1軸發(fā)揮抗血管生成的作用[8]，而尚未見青藤堿對(duì)實(shí)體瘤血管新生的體內(nèi)研究報(bào)道。本研究觀察鹽酸青藤堿在乳腺癌中的抗血管新生作用及其潛在的分子機(jī)制，旨在為臨床抗血管新生治療提供可能的藥物選擇和相關(guān)臨床前證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和動(dòng)物小鼠乳腺癌細(xì)胞4T 1由西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科封衛(wèi)毅教授惠贈(zèng)，168FARN由美國貝勒醫(yī)學(xué)院Jianming XU教授惠贈(zèng)，6～8周齡、體質(zhì)量18～20 g的BALB/c小鼠購自西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。于西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室SPF環(huán)境下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物飼養(yǎng)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)小鼠乳腺癌細(xì)胞株4T 1、168FARN培養(yǎng)于含100 mL/L胎牛血清、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)液（Hyclone，美國）中，置于含50 mL/L CO2的37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，2.5 g/L胰酶消化傳代。取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 小鼠原位移植瘤模型取對(duì)數(shù)生長期4T 1細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，于小鼠第四乳頭下脂肪墊內(nèi)注射1×106個(gè)細(xì)胞，每天觀察腫瘤生長情況，每2～3 d測量小鼠體質(zhì)量變化以及腫瘤的長短徑。細(xì)胞注射后24 h開始，每天經(jīng)腹腔注射含有特定濃度鹽酸青藤堿（陜西寶雞永嘉天然植物開發(fā)有限公司）的生理鹽水0.2 mL（5 mg/mL或10 mg/mL），對(duì)照組注射0.2 mL生理鹽水。每組6只小鼠，共給藥14 d，于第15天處死小鼠，30 min內(nèi)完整切除腫瘤，稱重后一半置于中性福爾馬林固定液中，一半切成條狀速凍于液氮中。

1.4 MTT法收集對(duì)數(shù)期4T 1細(xì)胞或168FARN細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，以相同細(xì)胞數(shù)接種至96孔板內(nèi)，待細(xì)胞貼壁后按照實(shí)驗(yàn)分組，分別給予含有不同終 濃度鹽 酸 青 藤 堿（0、31.25、62.5、125、250、500、1 000μmol/L）的細(xì)胞培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)20、44、68 h，每孔加入5 mg/mL的MTT 20μL，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h。小心棄去上清，每孔加入DMSO 150μL以溶解藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜，于搖床避光震蕩混勻10 min使結(jié)晶完全溶解。用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔在490 nm波長處吸光度（A）值，根據(jù)以下公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，繪制藥物的劑效曲線：各孔的增殖抑制率（growth inhibition）（%）=（1―實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值）×100%。

1.5 免疫組化染色腫瘤組織經(jīng)中性福爾馬林固定，石蠟包埋后切片，經(jīng)脫蠟水化，修復(fù)抗原后50 g/L牛血清白蛋白封閉，滴加CD31抗體（Abcam，英國），4℃過夜，二抗孵育后DAB顯色，蘇木素復(fù)染。使用Olympus光學(xué)照相系統(tǒng)采集圖像，在每張切片癌巢區(qū)域隨機(jī)抓拍5張，采用Imagepro-Plus6.0顯微鏡圖像分析軟件，計(jì)算CD31陽性區(qū)域的面積（代表新生血管面積），取5張切片的平均值反映1個(gè)標(biāo)本的血管新生情況。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）按文獻(xiàn)報(bào)道制備瘤組織腫瘤細(xì)胞外液（TEF）樣品[9]：瘤組織液氮速凍后，壓碎成直徑小于2 mm的碎片，按照質(zhì)量︰體積=1︰2的比例用2×PBS重懸組織碎片，并于4℃旋轉(zhuǎn)2 h，渦旋震蕩后2 200g離心3 min，收集上清至新EP管即為TEF；培養(yǎng)細(xì)胞的裂解液制備：采用不同濃度鹽酸青藤堿（0、62.5、250、1 000μmol/L）處理4T 1或168FARN細(xì)胞系24或48 h后，經(jīng)胰酶消化，1 000 g離心10 min收集細(xì)胞后置于冰上，加入預(yù)冷的PBS反復(fù)洗滌3次以去除殘留培養(yǎng)基，將清洗過的細(xì)胞重懸于PBS后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度一致并轉(zhuǎn)移相同體積至提前標(biāo)記好的EP管中，然后置于?20℃過夜。經(jīng)過2輪反復(fù)凍融破壞細(xì)胞膜后，于2～8℃10 000 g離心10 min，取上清立即檢測。將堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）ELISA試劑盒（武漢華美生物工程有限公司）及樣品置于室溫復(fù)溫，將準(zhǔn)備好的標(biāo)準(zhǔn)品或樣品各100μL至檢測孔中，4℃孵育過夜，次日根據(jù)試劑盒說明書依次加入二抗、TMB底物和終止液，立即在酶標(biāo)儀讀取450 nm處A值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品及其A值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，保證R2>0.98，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方程計(jì)算樣品中bFGF的濃度。

1.7 RT-qPCR不同濃度鹽酸青藤堿（0、250、1 000μmol/L）處理4T 1或168FARN細(xì)胞系24或48 h，分別提取各組細(xì)胞總RNA，按TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)，每組設(shè)定3個(gè)復(fù)孔。FGF2特異性引物為5′-CTACAACTCCAAGCAGAAGA-3′和5′-GT?TATTAGATTCCAGTCGTTCAA-3′。擴(kuò)增條件：96℃預(yù)溫5 min，隨后進(jìn)行96℃30 s、57℃30 s和72℃30 s的擴(kuò)增，共40個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。

1.8 在線生存分析使用Kaplan-Meier Plotter在線生存分析軟件（http://kmplot.com/analysis/）[10]分析bFGF表達(dá)與乳腺癌患者生存情況的關(guān)系。該軟件可以用來評(píng)估基因與腫瘤生存的關(guān)系，所采用的數(shù)據(jù) 來 源 于GEO（Gene Expression Omnibus）、EGA（European Genome-Phenome Archive）和TCGA（The Cancer Genome Atlas）三大開放數(shù)據(jù)庫，其中包括了1 117例乳腺癌患者總生存（OS）、3 554例乳腺癌患者的無復(fù)發(fā)生存（RFS）和1 609例乳腺癌患者的無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存（DMFS）數(shù)據(jù)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 17.0（Chi?cago，IL，USA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并采用Levene檢驗(yàn)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，P>0.05表明符合方差齊性假設(shè)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)兩組之間的差異比較采用Student’st檢驗(yàn)；多組之間的比較采用ANOVA檢驗(yàn)，各組與對(duì)照組之間的比較采用Dunnett事后檢驗(yàn)。不同鹽酸青藤堿劑量和給藥后時(shí)間對(duì)腫瘤細(xì)胞裂解液中bFGF濃度、mRNA表達(dá)及原位移植瘤體積的影響采用析因分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 鹽酸青藤堿的體內(nèi)抑瘤作用與對(duì)照組比較，100 mg/kg鹽酸青藤堿組的4T 1原位移植瘤生長抑制（P<0.01），瘤重減少（P<0.05），而50 mg/kg鹽酸青藤堿對(duì)腫瘤生長無明顯抑制；析因分析顯示，鹽酸青藤堿劑量和給藥時(shí)間對(duì)4T 1原位移植瘤體積有影響（P<0.001），且二者對(duì)腫瘤體積的影響有交互作用（P<0.001）；本研究所用的劑量范圍和干預(yù)時(shí)間內(nèi)，4T 1移植瘤模型的小鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，圖1），提示50～100 mg/kg鹽酸青藤堿未產(chǎn)生明顯系統(tǒng)毒性。

圖1 鹽酸青藤堿的體內(nèi)抑瘤作用Fig.1 The inhibitory effect of SH on tumor growth in vivo

2.2 鹽酸青藤堿對(duì)體內(nèi)血管新生的抑制作用體外MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，鹽酸青藤堿在24～72 h對(duì)4T 1細(xì)胞增殖抑制作用的IC50值均大于1 000μmol/L（圖2A），在24～48 h對(duì)于168FARN細(xì)胞增殖抑制作用的IC50值均大于1 000μmol/L，在72 h大于500μmol/L（圖2B）。

小鼠原位移植瘤組織中內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記分子染色顯示，鹽酸青藤堿干預(yù)組CD31+內(nèi)皮細(xì)胞占瘤組織面積的百分比少于對(duì)照組（P<0.01，圖2C、2D），提示腫瘤內(nèi)新生血管面積下降，證明了鹽酸青藤堿的抗血管新生作用。

圖2 鹽酸青藤堿對(duì)體內(nèi)血管新生的抑制作用Fig.2 The anti-angiogenic effect of SH in vivo

2.3 鹽酸青藤堿對(duì)bFGF的生成和分泌的影響ELISA定量檢測結(jié)果顯示，鹽酸青藤堿組的TEF中的bFGF較對(duì)照組下降（P<0.01，圖3A），提示4T 1原位移植瘤的血管新生減少與組織間液中bFGF的濃度下降有關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，4T 1及168FARN細(xì)胞裂解液中，鹽酸青藤堿組的bFGF水平下降（P<0.05，圖3D、3E），提示鹽酸青藤堿的抗血管新生作用與其對(duì)腫瘤細(xì)胞分泌的血管生成因子——bFGF生成的抑制作用相關(guān)。析因分析顯示，鹽酸青藤堿劑量對(duì)4T 1細(xì)胞裂解液中bFGF濃度有影響（P<0.001）；給藥后時(shí)間對(duì)4T 1細(xì)胞裂解液中bFGF濃度無影響（P=0.104）；鹽酸青藤堿劑量和給藥后時(shí)間對(duì)4T 1細(xì)胞裂解液中bFGF濃度的影響無交互作用（P=0.377）。鹽酸青藤堿劑量對(duì)168FARN細(xì)胞裂解液中bFGF水平有影響（P<0.001）；給藥后時(shí)間對(duì)168FARN細(xì)胞裂解液中bFGF水平無影響（P=0.692）；鹽酸青藤堿劑量和給藥后時(shí)間對(duì)168FARN細(xì)胞裂解液中bFGF水平影響無交互作用（P=0.479）。

RT-qPCR結(jié)果顯示，鹽酸青藤堿組bFGF的mRNA表達(dá)也出現(xiàn)下降（P<0.05，圖3B、3C），提示鹽酸青藤堿通過抑制bFGF轉(zhuǎn)錄進(jìn)而影響其蛋白表達(dá)。析因分析顯示，鹽酸青藤堿劑量及給藥后時(shí)間對(duì)4T 1細(xì)胞bFGF的mRNA表達(dá)有影響（P<0.001；P=0.028）；鹽酸青藤堿劑量和給藥后時(shí)間對(duì)4T 1細(xì)胞bFGF mRNA表達(dá)影響無交互作用（P=0.238）。鹽酸青藤堿劑量及給藥后時(shí)間對(duì)168FARN細(xì)胞bFGF的mRNA表達(dá)有影響（P<0.001；P=0.011）；鹽酸青藤堿劑量和給藥后時(shí)間對(duì)168FARN細(xì)胞bFGF mRNA表達(dá)影響有交互作用（P=0.012）。以上結(jié)果提示，鹽酸青藤堿通過抑制腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生、分泌bFGF，而降低TEF中bFGF水平，進(jìn)而影響對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的作用，減少血管新生。

圖3 鹽酸青藤堿對(duì)bFGF生成和分泌的影響Fig.3 The inhibitory effect of SH on bFGF production and secretion

2.4 bFGF表達(dá)與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系通過Kaplan-Meier Plotter在線生存分析軟件對(duì)bFGF mRNA表達(dá)與乳腺癌患者預(yù)后進(jìn)行相關(guān)性分析，所有隨訪患者按照bFGF的mRNA表達(dá)大于或小于中位值（median）分為bFGF高表達(dá)組（紅色曲線）和bFGF低表達(dá)組（黑色曲線），分別選取OS、RFS和DMFS作為終點(diǎn)（endpoint），兩組患者生存曲線分析結(jié)果顯示，bFGF高表達(dá)乳腺癌患者的OS更差（HR=1.41，95%CI1.11～1.79，P<0.01，N=1 117）、RFS（HR=1.31，95%CI1.17～1.47，P<0.001，N=3 554）以及DMFS（HR=1.36，95%CI1.11～1.67，P<0.01，N=1 609，圖4）。這證明bFGF mRNA高表達(dá)與乳腺癌患者較差預(yù)后相關(guān)，提示鹽酸青藤堿在抑制乳腺癌細(xì)胞表達(dá)bFGF的同時(shí)，可能會(huì)延長乳腺癌移植模型動(dòng)物及乳腺癌患者的生存期。

圖4 bFGFmRNA表達(dá)與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系Fig.4 Correlation between bFGF mRNA expression and the survival of the patients with breast cancer

3 討 論

血管新生在乳腺癌的生長和轉(zhuǎn)移中均發(fā)揮重要作用，尋找有效的抗血管新生藥物是乳腺癌研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。既往研究發(fā)現(xiàn)，鹽酸青藤堿的抗腫瘤作用主要依賴于對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的直接抑制，很少關(guān)注鹽酸青藤堿對(duì)于腫瘤血管的影響，而腫瘤血管在腫瘤微環(huán)境中卻有非常重要的作用，微環(huán)境狀態(tài)直接或間接影響著腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性、增殖或轉(zhuǎn)移的能力以及聯(lián)合治療的效果，以至患者的預(yù)后[11]。4T 1乳腺癌細(xì)胞系來源于BALB/c小鼠，進(jìn)展迅速，易于發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，常用來模擬人的Ⅳ期乳腺癌。本研究以小鼠4T 1細(xì)胞系為研究對(duì)象，乳腺癌原位移植瘤模型研究結(jié)果顯示，鹽酸青藤堿可抑制4T 1乳腺癌移植瘤的生長；體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，鹽酸青藤堿對(duì)4T 1細(xì)胞增殖抑制作用的IC50值明顯高于其他已知抗腫瘤藥物對(duì)乳腺癌細(xì)胞系增殖抑制作用的IC50值[12]。提示鹽酸青藤堿的體內(nèi)抑瘤作用的機(jī)制并非源于其對(duì)腫瘤細(xì)胞直接的毒性殺傷作用，而是通過細(xì)胞毒作用以外的藥理作用抑制腫瘤的生長。進(jìn)一步的研究證實(shí)鹽酸青藤堿可通過抗腫瘤血管新生產(chǎn)生抑瘤效應(yīng)，其在該4T 1乳腺癌原位移植瘤研究模型中的抗腫瘤作用主要依賴于對(duì)腫瘤間質(zhì)的影響，而其對(duì)腫瘤的多個(gè)其他生物學(xué)行為的影響，尚需進(jìn)一步研究。

bFGF作為已知的促血管生成效應(yīng)最強(qiáng)的因子之一，幾乎參與了血管新生的所有步驟，比如基底膜的降解，內(nèi)皮細(xì)胞向間質(zhì)遷移、出芽以及增殖[13]。本研究體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，鹽酸青藤堿干預(yù)組的腫瘤組織中bFGF的水平下降了40%，同時(shí)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)還證實(shí)了這一變化是由于鹽酸青藤堿抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)bFGF的mRNA表達(dá)。有研究報(bào)道，在角膜內(nèi)皮細(xì)胞中IL-1β可誘導(dǎo)IκB降解，促進(jìn)NF-κB的激活，而活化的NF-κB可以結(jié)合到bFGF的DNA啟動(dòng)子區(qū)域啟動(dòng)bFGF的轉(zhuǎn)錄，提示在這一條件下bFGF作為NF-κB的靶基因直接受其調(diào)控[14]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231（三陰性型）中，鹽酸青藤堿可以劑量依賴性地促進(jìn)NF-κB和IκB的結(jié)合，抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)位，使NF-κB的靶基因膽囊收縮素（CCK）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)和白介素-11（IL-11）蛋白水平下降，提示鹽酸青藤堿可抑制NF-κB的活性[15]。雖然已有一些研究證實(shí)鹽酸青藤堿可以抑制NF-κB的水平和活性發(fā)揮抗炎和逆轉(zhuǎn)化療耐藥等作用，但其是否是通過調(diào)節(jié)NF-κB從而抑制bFGF的表達(dá)水平仍需要進(jìn)一步探索。

綜上所述，鹽酸青藤堿可通過抑制bFGF誘導(dǎo)的血管新生產(chǎn)生抑瘤作用。而通過臨床數(shù)據(jù)分析顯示bFGF的高表達(dá)與乳腺癌患者生存較差相關(guān)，提示鹽酸青藤堿可能通過抑制bFGF發(fā)揮抗腫瘤作用的同時(shí)，改善患者預(yù)后。而鹽酸青藤堿可否作為一種新型抗腫瘤藥物應(yīng)用于臨床仍需要更深入的臨床前研究。