袁荷芳 耿成鋼 高蕙文 蔣曉勤 余花

隨著生活水平的不斷提高，人們對農(nóng)產(chǎn)品的品質(zhì)和安全越來越關(guān)注，在追求營養(yǎng)豐富的同時，也希望享用綠色、無公害、低殘留的農(nóng)產(chǎn)品。但目前抗生素在獸醫(yī)臨床和飼料中大量使用，導(dǎo)致獸藥殘留的問題越來越突出。其中，喹諾酮（quinolone antibiotics，QNs）是一類高效且價格低廉的廣譜抗菌藥，廣泛應(yīng)用于畜牧和水產(chǎn)養(yǎng)殖中，成為影響水產(chǎn)品和肉制品質(zhì)量安全的主要因素。國際食品法典委員會、歐盟、日本及中國均制訂出相應(yīng)的最高殘留限量，根據(jù)不同動物品種、組織和藥物種類，QNs的最高殘留限量為10-6000μg/kg。

關(guān)于喹諾酮類藥物殘留的檢測方法，目前應(yīng)用較多的是酶聯(lián)免疫吸附測定法、高效液相色譜-熒光法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等，其中，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有選擇性強、靈敏度高等優(yōu)點，在喹諾酮類藥物殘留的檢測中應(yīng)用較多。本文建立了一種超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，可以同時測定水產(chǎn)品中16種喹諾酮類藥物殘留。具體來說，先在樣品中加入1%的乙酸-乙腈，再依次進行漩渦混合、超聲波提取、正己烷去脂、氮吹，然后用0.2%的甲酸水溶液復(fù)溶，經(jīng)C18色譜柱分離后，采用0.2%的甲酸水和乙腈作為流動相進行梯度洗脫，最后在ESI+模式下，采用多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）方式進行掃描。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各組分在5-200ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.996;檢出限為0.5-1.0μg/kg，定量限為1.0-2.0μg/kg，3個添加水平（n=6）的回收率為79.3%-99.3%，相對標準偏差為1.5%-8.8%。實驗結(jié)果表明，本文建立的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速、靈敏、準確，適用于水產(chǎn)品中喹諾酮的檢測。

一、儀器與試劑

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源（ESI）QTRAP 4500，SCIEX;高速冷凍離心機X4 PRO，ThermoFisher;IKA MS3漩渦混合器，IKA;Milli-Q超純水儀，Millipore;色譜純乙腈、甲醇，Merck;喹諾酮標準品均購于Dr。

二、溶液的配制

1.標準儲備液。準確稱取按其濃度折算為100%質(zhì)量的16種喹諾酮標準品各10mg（精確至0.0001g），置于10mL容量瓶中，用1%的乙酸乙腈溶解并定容至刻度，濃度為1mg/mL。在4℃條件下避光保存，有效期6個月。

2.混合標準中間液。準確移取標準儲備液0.1mL于100mL容量瓶中，用1%的乙酸乙腈定容，配制成濃度為10μg/mL的混合標準中間液。

3.混合標準工作液。分別準確移取0.1mL、0.2mL、0.4mL、1.0mL、2.0mL、4.0mL混合標準中間液于10mL容量瓶中，用空白樣品基質(zhì)溶液定容至刻度，配制成濃度分別為5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的混合標準工作液?，F(xiàn)配現(xiàn)用。

三、實驗與方法

1.樣品前處理。稱取5g（精確到0.01g）均質(zhì)試樣于50mL離心管中，加入10g無水硫酸鈉，渦旋混勻，再加入1%的乙酸乙腈溶液15mL，超聲提取10min，在10℃以下8000r/min離心5min，然后將上清液轉(zhuǎn)移至另一潔凈的離心管中。重復(fù)上述提取1次，合并上清液，加入10mL正己烷，混合1min，在10℃以下8000r/min離心5min，棄去正己烷層。加入5mL異丙醇，渦旋混勻，氮吹至近干。用2mL初始流動相溶解殘渣，再加入2mL正己烷，渦旋1min，8000r/min離心5min。棄去上層（正己烷層），過0.22μm濾膜，待測定。

2.液相色譜條件。色譜柱為Thermo Hypersil GOLD C18（2.1mm×50mm，1.9?m），流速為0.2mL/min，柱溫為40℃，進樣量為2μL，流動相A為0.2%甲酸水溶液，流動相B為甲醇，梯度洗脫條件如表1所示。

3.質(zhì)譜條件。離子化方式：電噴霧電離;掃描方式：正離子掃描;檢測方式：多重反應(yīng)監(jiān)測;離子源溫度：550℃;電噴霧電壓：5500V;氣簾氣壓力：35psi;霧化氣壓力：55.0psi;輔助氣壓力：55.0psi。

四、結(jié)果與分析

1.質(zhì)譜條件的優(yōu)化。喹諾酮類化合物的分子結(jié)構(gòu)中含有羰基等多電子基團，易于在ESI源的正離子模式下形成[M+H]+準分子離子。配制含16種喹諾酮（100ng/mL）的標準溶液，采用針泵進樣方式將其注入離子源，在正離子檢測模式下進行優(yōu)化，確定碎片離子有最大響應(yīng)強度時的最佳碰撞電壓值。

2.色譜條件的優(yōu)化。使用濃度為10ng/mL的混合標準溶液，考察液相色譜流動相類型和酸度對靈敏度和分離度的影響。喹諾酮類化合物為酸堿兩性化合物，其解離狀態(tài)和在流動相中的溶解性隨流動相的pH值而變化，在流動相中加入一定比例的有機酸可以顯著提高兩性喹諾酮的分離度和離子化效率。本實驗分別采用濃度為0.1%、0.2%和0.3%的甲酸水溶液作為流動相，比較酸性增強，峰型有所改善，響應(yīng)提高;當甲酸比例超過0.2%時，多數(shù)化合物響應(yīng)有所降低，綜合考慮，選擇濃度0.2%的甲酸溶液作為水相流動相。

3.前處理方法優(yōu)化。喹諾酮類化合物的分子結(jié)構(gòu)中含有羧基和叔胺基，因此具有酸堿兩性性質(zhì)，易溶于酸性或堿性溶液。本實驗分別采用純有機溶劑和添加一定比例乙酸的有機溶劑提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙腈能夠使樣品蛋白質(zhì)變性，利于目標物的提取;添加了乙酸的有機溶液可以顯著提高回收率，酸性增強，有利于目標化合物的提取，但有機酸比例過高則不利于濃縮，綜合考慮，本實驗采用濃度為1%的乙酸乙腈溶液進行提取。

4.基質(zhì)效應(yīng)的影響。由于基質(zhì)效應(yīng)的存在，基質(zhì)提取液和純?nèi)軇┲心繕朔治鑫镌谫|(zhì)譜中的響應(yīng)不同，根據(jù)目標分析物質(zhì)譜信號消減和增強，基質(zhì)效應(yīng)的影響可分為離子抑制和離子增強兩種情況，不同樣品基質(zhì)對各種喹諾酮類化合物離子化的抑制情況存在顯著差異。為消除樣品基質(zhì)效應(yīng)的影響，本實驗以空白樣品提取液作為標準溶液的稀釋溶液，可使標準和樣品溶液具有同樣的離子化條件，從而降低了樣品基質(zhì)效應(yīng)。

本實驗建立了一種超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，能夠同時測定水產(chǎn)品中16種喹諾酮類藥物殘留，快速、靈敏、準確，適用于水產(chǎn)品中喹諾酮的檢測，也能為水產(chǎn)品的安全風(fēng)險監(jiān)測與監(jiān)管工作提供技術(shù)支持。

作者簡介：袁荷芳（1984-），女，漢族，江蘇常州人，碩士研究生，高級工程師，研究方向為食品理化檢驗。

*通信作者：蔣曉勤（1988-），女，漢族，江蘇常州人，碩士研究生，主管藥師，研究方向為食品檢驗。