代紅燕，趙一蔚，任培樂，聶永梅，2

1 新疆醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院機能中心實驗室，烏魯木齊830000；2 西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院大血管外科

動脈粥樣硬化（AS）是許多心血管疾病的病理基礎，嚴重威脅人類的身體健康。剪切應力改變可使血管內(nèi)膜局部受損并促進斑塊形成，被認為是與AS發(fā)生及斑塊破裂最為相關的力學因素，其對血管內(nèi)皮細胞結構和功能的影響已成為AS 研究的熱點［1-2］。血管內(nèi)皮細胞可感受細胞外環(huán)境中的力學機械刺激，通過機械敏感性離子通道激活細胞信號轉(zhuǎn)導途徑，影響細胞的增殖、分化、遷移及凋亡，對維持血管正常功能有著重要意義［3］。Piezo是一種新型的機械敏感性離子通道蛋白，能夠直接感受到膜上的機械力來讓離子通過［4］。有研究發(fā)現(xiàn)，通道蛋白Piezo1 與心血管疾病有關，其與AS 的發(fā)生發(fā)展機制是否有直接聯(lián)系尚未闡明［5］。2018年6 月—2021年6 月，本研究通過建立兔AS 模型，觀察了AS 發(fā)生發(fā)展過程中主動脈弓部血管內(nèi)膜厚度及血管壁中Piezo1 蛋白的表達水平，并分析兩者的相關性，以期為AS血管重構提供新的思路及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性新西蘭大白兔32 只，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，3～4 月齡，由新疆醫(yī)科大學動物實驗中心提供。蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒購自新疆寶信生物科技有限公司，兔蛋白抗體Piezo1 檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。石蠟切片機購自美國賽默飛，電熱恒溫水浴鍋購自無錫馬瑞特科技有限公司。

1.2 分組處理與AS模型制作 大白兔適應性喂飼1周后隨機分為對照組8只、AS模型組24只，分籠飼養(yǎng)，自由飲水。對照組給予普通飼料喂飼，AS 模型組給予高脂飼料（83.5%基礎飼料+1.5%膽固醇+5%蛋黃粉+10% 豬油）喂飼；每日每只喂飼量為120～140 g，兩組均給予4 mL/kg 生理鹽水灌胃，1次/天，連續(xù)12周。

1.3 主動脈血管壁組織獲取 于造模前及造模后4、8、12 周在禁食12 h 后，以空氣栓塞法處死兩組實驗兔各2 只，放于手術臺上迅速開胸，充分暴露心臟，分離主動脈，切取主動脈瓣至腹主動脈分叉處，剝除結締組織及脂肪?？v行剖開截取的血管，在生理鹽水中漂洗組織上的殘血和附著的脂肪組織；在主動脈弓處取0.5 cm 血管壁組織，放入4% 多聚甲醛溶液中保存；脫水包埋，石蠟切片；同一標本平行切片3張，厚度均為4 μm，用于后續(xù)實驗。

1.4 血管壁組織形態(tài)觀察 采用HE 染色。取兩組主動脈血管壁組織切片烘片20 min 后，加入二甲苯作用20 min，放入梯度乙醇中。入蘇木精液染色5 min，加入1%鹽酸乙醇液分化。分化后轉(zhuǎn)入自來水中沖洗，將切片置入75%乙醇伊紅液，放入梯度乙醇中脫水。風干切片，滴加中性樹膠于組織上，取清潔蓋玻片覆蓋，顯微鏡下觀察組織形態(tài)。

1.5 血管內(nèi)膜厚度測量 對HE 染色后的切片采集圖象，采用OLYSIA 軟件導入標尺，測定主動脈血管內(nèi)膜厚度。

1.6 血管壁Piezo1 表達檢測 采用ELISA 法。取主動脈血管壁組織樣本，加入0.9% 氯化鈉注射液低溫（-3 ℃至-1 ℃）高速（1 250 r/min）勻漿制成10 %～20 %勻漿液，4 ℃下離心（13 500 r/min）25 min，取上清4 ℃存放。使用兔蛋白抗體包被微孔板，制成固相抗體；在包被單抗的微孔板中依次加入血管壁組織勻漿，再與辣根過氧化物酶標記的蛋白抗體結合，形成抗體—抗原—酶標抗體復合物；經(jīng)過徹底洗滌后，加底物TMB 顯色。TMB 在辣根過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)變成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的蛋白呈正相關。用酶標儀在450 nm 波長下測定光密度（OD）值，通過標準曲線計算通道蛋白Piezo1表達水平。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以± s 表示，組間比較行獨立樣本t檢驗，組內(nèi)不同時間點比較采用重復測量方差分析，主動脈血管內(nèi)膜厚度和Piezo1 表達的關系采用Pearson 相關分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組血管壁組織形態(tài)觀察結果 對照組主動脈血管壁分層清楚、內(nèi)膜光滑、無增厚，內(nèi)皮下無泡沫細胞沉積，平滑肌細胞走行良好。AS模型組造模第4、8 周，主動脈血管壁呈點狀突起，內(nèi)膜增厚；造模第12 周，主動脈血管壁大部分有點狀隆起，可見斑塊沿管腔分布甚至布滿全周，內(nèi)膜增厚，含許多泡沫細胞及脂質(zhì)沉積，平滑肌細胞排列不規(guī)則。見OSID碼圖1。

2.2 兩組血管內(nèi)膜厚度、Piezo1 表達水平比較 與對照組同時點比較，AS模型組造模后各時點血管內(nèi)膜厚度、Piezo1 表達水平均增加；與造模前比較，AS模型組造模后各時點血管內(nèi)膜厚度、Piezo1 表達水平均增加（P<0.05）。見表1。

表1 主動脈血管內(nèi)膜厚度、血管壁Piezo1表達水平比較（±s）

表1 主動脈血管內(nèi)膜厚度、血管壁Piezo1表達水平比較（±s）

注：與對照組比較，*P<0.05；與造模前比較，#P<0.05。

組別對照組造模前造模4周造模8周造模12周AS模型組造模前造模4周造模8周造模12周n 8 8血管內(nèi)膜厚度（μm）35.75 ± 3.67 37.88 ± 4.01 39.50 ± 4.32 41.37 ± 4.27 38.00 ± 3.32 69.38 ± 6.08*#115.63 ± 9.03*#193.00 ± 5.12*#Piezo1 64.88 ± 5.85 68.00 ± 4.85 70.75 ± 4.87 73.88 ± 4.17 64.00 ± 3.74 104.57 ± 4.27*#162.86 ± 5.22*#227.43 ± 5.75*#

2.3 血管內(nèi)膜厚度與Piezo1 表達的相關性 相關性分析顯示，造模4、8、12 周血管內(nèi)膜厚度與Piezo1含量均呈正相關（r0.53，P=0.043；r=0.65，P=0.038；r=0.78，P=0.025）。

3 討論

目前，比較公認的AS形成機制是血管內(nèi)皮損傷學說、脂質(zhì)浸潤學說和炎癥反應學說。內(nèi)皮損傷是多種因素刺激對血管內(nèi)皮細胞造成損傷，使血管內(nèi)皮細胞發(fā)生功能及器質(zhì)性的改變，脂質(zhì)經(jīng)破損的血管內(nèi)皮沉積到血管壁、平滑肌細胞間，引起平滑肌細胞增殖。內(nèi)皮功能障礙及血管重構（彈性減弱、僵硬度增加、內(nèi)膜増生）是早期AS的主要病理特征，而血管重構既是AS 的病理基礎，也是AS 發(fā)生發(fā)展的結構基礎。血管重構的發(fā)生發(fā)展與多種因素有關，包括血流動力學的改變，血管活性物質(zhì)的變化等。血管壁作為與血流直接接觸的屏障，可在血液剪切應力變化時，將剪切應力對變化轉(zhuǎn)化成信號傳遞給鄰近的細胞，釋放相應的血管活性物質(zhì)，從而影響細胞外基質(zhì)，使血管作出相應的改變應答。本研究結果顯示，高脂飼料喂飼實驗兔4、8、12 周，主動脈弓部血管壁內(nèi)膜逐漸增厚。建模12周后，主動脈斑塊沿管腔分布甚至布滿全周，血管內(nèi)膜含許多泡沫細胞及脂質(zhì)沉積，主動脈弓血管壁發(fā)生結構重構，提示AS模型建立成功。

機械敏感性離子通道蛋白Piezo1是近年來發(fā)現(xiàn)的內(nèi)皮細胞膜上對機械刺激敏感的感受器之一，對內(nèi)皮細胞有重要作用。Piezo1 通道作為陽離子通道可以調(diào)節(jié)哺乳動物的機械敏感傳導，其在干細胞中的過度表達能夠產(chǎn)生強烈的非選擇性機械陽離子電流，該作用與Ca2+流動相關［6］。Piezo1蛋白由Piezo1/FAM38A 基因編碼，預計由包含了30 個跨膜區(qū)域的約2 500 個氨基酸構成，參與細胞發(fā)育、血管容量調(diào)節(jié)、細胞遷移以及細胞的增殖和延長等過程，通過阻斷劑GsMTx4 可以抑制其活性［7］。研究顯示，Piezo1在小鼠發(fā)育血管的內(nèi)皮細胞中表達，其基因的缺失在妊娠中期影響血管重構，可造成小鼠胚胎發(fā)育的致命性損傷［8］。Piezo1是血管區(qū)域的重要部分，在體外層流剪切應力的作用下，Piezo1 的機械力傳導與細胞的形態(tài)學調(diào)節(jié)有關，血管內(nèi)皮細胞中Piezo1 的缺失，會造成細胞排列缺陷［9］。有研究顯示，運動過程中血流可以影響Piezo1 這一機械通道，最終引起血管的收縮［10］。本研究結果顯示，隨著造模時間延長，AS 模型主動脈血管壁中Piezo1 表達增加，并與血管內(nèi)膜厚度呈正相關。其原因可能為血液流變剪切應力作用激活了血管內(nèi)皮細胞上的通道蛋白Piezo1，引起血管皮細胞形態(tài)和功能改變，從而造成血管內(nèi)皮細胞損傷及內(nèi)膜增生。

綜上所述，本研究成功構建了兔AS 模型，并發(fā)現(xiàn)主動脈血管壁通道蛋白Piezo1及血管內(nèi)膜厚度隨著AS 的發(fā)生發(fā)展均有增加。 這提示通道蛋白Piezo1 參與AS 的發(fā)生發(fā)展，該機制可能與剪切應力的變化激活通道蛋白Piezo1，引起血管內(nèi)皮細胞受損從而導致血管重構有關。