陳宇晟 王 瑞 張 力 陳洪雷

(1.武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室 武漢 430000；2.湖北省襄陽市中心醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科 襄陽 441000)

肺癌對(duì)我國(guó)乃至全球人類健康都構(gòu)成了嚴(yán)重威脅，從2015到2020年底，僅僅5年時(shí)間，肺癌病例就累計(jì)達(dá)81.5萬[1]，位居我國(guó)惡性腫瘤的首位，其5年生存率(11%～15%)較低的現(xiàn)狀仍沒有改變。腫瘤的免疫微環(huán)境在腫瘤的惡性進(jìn)展中起著關(guān)鍵的作用。吲哚胺2，3雙加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase, IDO1)可以促進(jìn)色氨酸的分解，在腫瘤免疫逃逸中發(fā)揮重要作用[2]。IDO1與人肺腺癌(lung adenocarcinoma, LUAD)臨床病理參數(shù)的關(guān)系，國(guó)內(nèi)外報(bào)道鮮見，這也是本次研究的重點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究共選取了120例獨(dú)立的被確診為肺腺癌患者的組織，并記錄了患者詳細(xì)的臨床數(shù)據(jù)。所有患者的標(biāo)本都是在接受放化療之前的手術(shù)標(biāo)本。利用2015年WHO確定的肺癌的組織學(xué)分類對(duì)這120例LUAD組織標(biāo)本進(jìn)行病理診斷和組織學(xué)分級(jí)。所有的標(biāo)本都是由兩名病理學(xué)家獨(dú)立評(píng)估兩次從而確認(rèn)肺腺癌的診斷和組織學(xué)特征。通過國(guó)際抗癌聯(lián)盟第8次修訂的TNM(UICC 2017)進(jìn)行更為具體的分期，101例患者(84.17%)分為I期，6例(5%)分為II期，4例(3.33%)分為III期，9例(7.5%)分為IV期。本研究遵照1964年《赫爾辛基宣言》和它們的后繼條款以及相對(duì)應(yīng)的道德規(guī)范來進(jìn)行，同時(shí)獲得了參與者和/或他們的知情法定監(jiān)護(hù)人的同意。本實(shí)驗(yàn)滿足武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)的有關(guān)規(guī)定并獲得了批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

免疫組化檢測(cè)IDO1的蛋白表達(dá)具體步驟如下：常規(guī)烤片、脫蠟和水化后，將組織完全浸泡在pH 9.0 EDTA中修復(fù)，使抗原充分被暴露出來，自然冷卻后，ddH2O沖洗，TBST沖洗。封閉：甩去TBST，用免疫組化筆畫圈，滴加封閉液孵育20min；滴加一抗：滴加稀釋后的一抗(IDO1 1∶100稀釋，美國(guó)CST公司抗體)，4℃孵育過夜；取出后恢復(fù)室溫，TBST洗2min ×3次；滴加HRP標(biāo)記的二抗：在37℃孵育1h后，TBST 緩沖液洗2min ×3次；顯微鏡觀察DAB顯色情況，在合適的時(shí)候用蒸餾水沖洗終止顯色；TBST 緩沖液洗滌3×2min；蘇木素染核10s，鹽酸酒精分化液10s；最后常規(guī)脫水透明封片，顯微鏡下觀察結(jié)果并成像。

1.3 免疫組化染色結(jié)果的判定

IDO定位于細(xì)胞的胞質(zhì)和胞膜，用染色陽性區(qū)域(Positive area，AP)、染色強(qiáng)度(Staining intensity，IS)半定量的法則來觀察，并對(duì)IDO1的表達(dá)情況進(jìn)行分析打分。AP評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)有：0(AP:0%～5%)，1(AP:5%～25%)，2(AP:26%～50%)，3(AP:51%～75%)和4(AP:>75%)，IS被分為0(陰性)，1(弱)，2(中等)，3(強(qiáng))。IDO1表達(dá)計(jì)算：強(qiáng)度分布(Intensity distribution，ID)=陽性區(qū)域(AP)×染色強(qiáng)度(IS)[3]，采用使用者工作特性曲線(ROC)確定IDO1表達(dá)的最佳截點(diǎn)，根據(jù)最佳靈敏度和最佳特異度確定的ROC曲線IDO1在腫瘤細(xì)胞中的最佳截點(diǎn)為2.0(≥2.0=高表達(dá)；<2.0=低表達(dá))。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究采用SPSS26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和計(jì)算，采用獨(dú)立樣本χ2檢驗(yàn)和精確概率法分析IDO1蛋白與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

本研究使用了免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)120例肺腺癌患者的IDO1蛋白的表達(dá)情況，本研究結(jié)果表明，IDO1在大多數(shù)人肺腺癌亞型中廣泛表達(dá)，并且具有明確的空間分布特征。其中在乳頭狀為主、腺泡狀為主還有實(shí)性為主的肺腺癌中高表達(dá)，但在貼壁細(xì)胞為主型的LUAD中低表達(dá)。不僅觀察到IDO1在腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)和胞膜上廣泛表達(dá)，也觀察到免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、癌旁異型增生的支氣管上皮細(xì)胞中也有IDO1的存在，但在正常支氣管上皮細(xì)胞呈陰性表達(dá)。根據(jù)診斷閾值，在肺腺癌組織中，IDO1高表達(dá)于40%(48/120)肺腺癌患者中，與正常肺組織相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。為了探索LUAD患者中IDO1的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系(表1)，本研究采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞中IDO1的表達(dá)與性別(P=0.006)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.011)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的關(guān)聯(lián)，而與其他臨床病理參數(shù)均無關(guān)(P>0.05)。

表1 IDO1蛋白表達(dá)與LUAD患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

3 討論

目前，以免疫微環(huán)境的干預(yù)為核心的免疫治療策略已經(jīng)在臨床上得到應(yīng)用，并且成為了NSCLC治療的熱點(diǎn)[4]。最近批準(zhǔn)了多種治療性抗體用于NSCLC的治療，關(guān)于阻斷這些免疫檢查點(diǎn)通道藥物的最佳使用仍然存在許多問題。最近的臨床進(jìn)展發(fā)現(xiàn)了IDO1在腫瘤發(fā)生中的重要作用，這提示IDO1將指導(dǎo)未來的生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)策略[5]。IDO1在色氨酸代謝中起到了關(guān)鍵性的作用，它通過將必需的氨基酸-色氨酸代謝成球蛋白來產(chǎn)生其生物學(xué)效應(yīng)[6]。IDO1既能下調(diào)T細(xì)胞的功能和表達(dá)水平，又可助于促進(jìn)腫瘤的血管形成。

本研究通過免疫組織化學(xué)技術(shù)研究了120例LUAD患者中IDO1蛋白的表達(dá)情況以及臨床病理意義。本研究發(fā)現(xiàn)，在大多數(shù)LUAD隊(duì)列中，IDO1在腫瘤組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；并且發(fā)現(xiàn)在部分異常增生的支氣管上皮，發(fā)現(xiàn)IDO1的高表達(dá)，而正常支氣管上皮細(xì)胞均呈陰性表達(dá)，據(jù)此可推測(cè)IDO1與LUAD的發(fā)生有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)IDO1在癌巢外圍表達(dá)比腫瘤細(xì)胞內(nèi)部信號(hào)更強(qiáng)，這或許與淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)有關(guān)。同時(shí)，通過研究發(fā)現(xiàn)，IDO1在不同的組織學(xué)亞型中表達(dá)強(qiáng)度并不相同，在浸潤(rùn)性腺癌中如腺泡型、乳頭型、實(shí)體型，IDO1高表達(dá)，但在貼壁為主的微浸潤(rùn)肺腺癌患者中IDO1低表達(dá)，并且與LUAD的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，所以由此推測(cè)IDO1的表達(dá)與肺腺癌的進(jìn)展有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)IDO1的高表達(dá)主要見于男性LUAD患者，可能與吸煙有關(guān)。與以往的研究不同的是[7]，IDO1高表達(dá)只占40%(48/120)，推測(cè)這可能與所選擇病例的臨床TNM分期有關(guān)，因?yàn)楸狙芯窟x擇的病例大多數(shù)都是I,II期的肺腺癌患者，所以可能導(dǎo)致檢測(cè)到IDO1高表達(dá)陽性率不高。

綜上所述，本研究結(jié)果表明：IDO1蛋白的高表達(dá)與LUAD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，作為色氨酸代謝第一步的限速酶，故推測(cè)靶向IDO1有可能為L(zhǎng)UAD的腫瘤免疫治療打開新的窗口。