尚月梅，陳國(guó)利?，楊艷梅，張賀

（1.新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊市疾病預(yù)防控制中心，新疆 烏魯木齊 830026；2.新疆維吾爾自治區(qū)沙依巴克區(qū)婦幼保健服務(wù)中心，新疆 烏魯木齊 830006）

0 引言

葡萄球菌廣泛分布于自然界，在空氣、水、塵埃、食物、污水及糞便中均可檢出，絕大多數(shù)對(duì)人不致病，少數(shù)可引起人或動(dòng)物化膿性感染，其中以金黃色葡萄球菌致病力最強(qiáng)。相關(guān)數(shù)據(jù)調(diào)查顯示：大約32%的金黃色葡萄球菌寄生在各類食物中且具有極強(qiáng)的繁殖能力，能產(chǎn)生數(shù)種引起急性胃腸炎的蛋白質(zhì)腸毒素[1]，腸毒素具有耐高溫的特點(diǎn)，120℃加熱20 min不能將其破壞[2]。金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的腸毒素是引起食物中毒的主要原因。近年來(lái)，我國(guó)由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒事件在全國(guó)已占據(jù)第四位。20%~25%的細(xì)菌性食物中毒病例是由金黃色葡萄球菌引起的。因此，加強(qiáng)食物中毒樣品中金黃色葡萄球菌及腸毒素檢測(cè)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

2020年10月21日，某市某學(xué)校陸續(xù)發(fā)現(xiàn)11名學(xué)生出現(xiàn)腹痛、腹瀉、嘔吐等癥狀，根據(jù)根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查分析疑似細(xì)菌性食物中毒，隨即將剩余食品進(jìn)行采樣，并送往實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果分析，證實(shí)為一起金黃色葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒。

1 研究樣品

1.1 樣品來(lái)源。留取食物樣本35份、嘔吐物4份。樣品在采集后4h內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢驗(yàn)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株。金黃色葡萄球菌（ATCC 25922）購(gòu)于廣東省微生物安全工程技術(shù)研究開發(fā)中心。

1.3 儀器設(shè)備。高壓滅菌器、 恒溫培養(yǎng)箱、生物安全柜、法國(guó)梅里埃全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)（VITEK 2 –compact）、顯微鏡、酶標(biāo)儀、BioMerieux Vitek公司的細(xì)菌濁儀、BD-MAX多重核酸檢測(cè)系統(tǒng)。

1.4 試劑。金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基（科瑪嘉）、血平板（鄭州安圖）、GPI鑒定卡（法國(guó)梅里埃）、7.5%氯化鈉肉湯（北京陸橋）、凍干血漿（北京陸橋）、金黃色葡萄球菌核酸實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒（北京卓誠(chéng)惠生）、金黃色葡萄球菌腸毒素A、B、C、D、E型核酸檢測(cè)熒光PCR試劑盒（北京生科原）、金黃色葡萄球菌ELISA法試劑盒（德國(guó)拜發(fā)）。

2 檢驗(yàn)方法

2.1 分離培養(yǎng)。檢驗(yàn)方法采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》GB4789.10-2016。食品樣品經(jīng)7.5%氯化鈉肉湯增菌，接種血平板和金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基平板，挑取典型菌落做血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)，血漿凝固酶陽(yáng)性的菌株再進(jìn)行全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)鑒定。

2.2 熒光定量PCR法。樣品經(jīng)7.5%氯化鈉肉湯增菌，取增菌液離心，棄去上清液，加80 ul無(wú)菌水，充分混勻振蕩，金屬浴100℃+10 min，13000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行試驗(yàn)，設(shè)定程序，進(jìn)行擴(kuò)增。

2.3 腸毒素的鑒定。分別用ELISA法和熒光PCR法進(jìn)行腸毒素分型檢測(cè)比對(duì)。

2.3.1 PCR方法：使用生科原金黃色葡萄球菌腸毒素A、B、C、D、E型核酸檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。取純菌于80 ul無(wú)菌水中，充分混勻振蕩，金屬浴100℃+10 min，13000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行試驗(yàn)，設(shè)定程序，進(jìn)行擴(kuò)增。

2.3.2 ELISA法：使用德國(guó)拜發(fā)金黃色葡萄球菌腸毒素分型檢測(cè)試劑盒進(jìn)行分型檢測(cè)。取純菌于BHI腦心浸出液肉湯隔夜增菌，5 min/3500 g離心，培養(yǎng)物上層液體進(jìn)行無(wú)菌過濾，每孔取100 ul濾液進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)加樣、孵育、洗板等操作，測(cè)量吸光度值。

3 結(jié)果

3.1 分離培養(yǎng)法及熒光定量法。通過對(duì)35份食物樣本和4份嘔吐物樣本進(jìn)行分離培養(yǎng)法及熒光定量法檢測(cè)，4份食物樣本及4份嘔吐物均檢測(cè)出金黃色葡萄球菌，其余樣本均未檢測(cè)出目標(biāo)菌，因嘔吐物樣本量不足，無(wú)法計(jì)數(shù)，只做了定性檢測(cè)。金黃色葡萄球菌計(jì)數(shù)及熒光定量法Ct值見表1。

表1 2種不同金黃色葡萄球菌的方法檢測(cè)結(jié)果

3.2 腸毒素檢測(cè)結(jié)果。對(duì)檢測(cè)出8份樣本中的金黃色葡萄球菌進(jìn)行腸毒素分型實(shí)驗(yàn)，采用了2中不同的方法，分別為PCR方法和ELISA法，結(jié)果每份樣本均檢出A、E型腸毒素，結(jié)果見表2。

表2 2種不同腸毒素的方法檢測(cè)結(jié)果

4 討論

食源性疾病已成為我國(guó)頭號(hào)食品安全問題[3]。食物中毒是常見的食源性疾病之一，是僅次于傳染病疫情的突發(fā)公共衛(wèi)生事件，學(xué)校食堂是發(fā)生集體食物中毒的高風(fēng)險(xiǎn)場(chǎng)所。金黃色葡萄球菌及腸毒素是導(dǎo)致食物中毒的重要致病因素，嚴(yán)重威脅著人體健康，隨著食品安全問題的逐漸深入，金黃色葡萄球菌及腸毒索檢測(cè)已經(jīng)受到世界衛(wèi)生組織格外關(guān)注的重點(diǎn)工作。在暴發(fā)事件調(diào)查中，可通過檢測(cè)產(chǎn)毒株或腸毒素以確定病因[4]。此次食物中毒事件中，食堂外環(huán)境因及時(shí)衛(wèi)生清潔工作，故沒有采到樣，只在食物和嘔吐物中分離出金黃色葡萄球菌。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室結(jié)果，判斷這是一起由金黃色葡萄球菌腸毒素污染食物所致的聚集性食源性疾病。因此，日常烹飪飲食時(shí)，應(yīng)該嚴(yán)格注意食品的安全衛(wèi)生，注意對(duì)熟食的保存，長(zhǎng)時(shí)期放置的食品，應(yīng)該小心食用。同時(shí)還應(yīng)該提高食物中毒預(yù)防意識(shí)、規(guī)避污染源，防止操作不當(dāng)對(duì)食品造成的污染。建議學(xué)校應(yīng)建立健全食品安全管理制度；在食品安全管理上，從進(jìn)貨、貯藏、加工、銷售各個(gè)環(huán)節(jié)嚴(yán)加管理，制定各項(xiàng)管理制度，做好各項(xiàng)登記記錄，嚴(yán)格按照制度執(zhí)行，并按期進(jìn)行督查，做好食品衛(wèi)生工作，防止食物中毒的發(fā)生[5]。

本實(shí)驗(yàn)采用了2種不同的檢測(cè)手段檢測(cè)金黃色葡萄球菌（國(guó)標(biāo)方法及熒光定量PCR法），兩種方法都檢測(cè)出了目標(biāo)菌，但各有利弊。PCR法用了食品增菌液直接做熒光定量PCR法，24 h即出結(jié)果，能快速找到引起突發(fā)公共衛(wèi)生事件的原因，但不能準(zhǔn)確檢測(cè)出食物中金黃色葡萄球菌的污染程度，而國(guó)標(biāo)法能彌補(bǔ)這點(diǎn)不足。

本實(shí)驗(yàn)還采樣了2種不同的檢測(cè)手段檢測(cè)金黃色葡萄球菌腸毒素，熒光定量PCR法能直接從分離出的金黃色葡萄球菌檢測(cè)出腸毒素，而ELISA法需要將分離出的金黃色葡萄球菌在BHI腦心浸出液肉湯中隔夜增菌后離心，再進(jìn)行檢測(cè)，操作步驟較繁瑣，實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)。

本實(shí)驗(yàn)利用不同檢測(cè)方法處理了一起由金葡菌引起的食物中毒事件，通過不同方法的比較，總結(jié)出了更快更有效的檢測(cè)手段，為烏魯木齊市金黃色葡萄球菌的日常監(jiān)測(cè)和相關(guān)疫情的處理打下了良好的基礎(chǔ)。