周麗麗，朱艷雯，姜曉霞，張 旋，檀德宏，劉 玲，白 冰*

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110866）

血栓性疾病包括動脈粥樣硬化、動脈血栓形成和深靜脈血栓形成[1]，越來越多的患者受此類疾病的困擾。止血作為有效的生理防御機(jī)制能夠保證血液在循環(huán)中正常流動，而止血障礙會加速血栓的形成[2]。除了血小板和凝血因子，凝血酶的激活和抑制在止血中也發(fā)揮了關(guān)鍵性作用[3]。凝血酶是一種損傷處血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的多功能蛋白酶，它參與凝血過程中各個關(guān)鍵性環(huán)節(jié)，主要將纖維蛋白原轉(zhuǎn)化成纖維蛋白，并與后者交聯(lián)形成血栓[4-5]。目前，抗凝血研究通常圍繞內(nèi)源性抗凝血途徑（活化時間凝血酶時間（activation time thrombin time，APTT））、外源性抗凝血途徑（凝血酶原時間（prothrombin time，PT））、共同抗凝血途徑（凝血酶時間（thrombin time，TT））以及降低纖維蛋白原（fibrinogen，F(xiàn)IB）開展?？诜种颇傅目鼓幬铮ㄈ缛A法林）是預(yù)防和治療血栓的常用方法。但目前常用的抗凝血藥物可能會帶來出血等健康風(fēng)險[6-7]。因此，尋找安全有效的抗凝血成分一直是人們關(guān)注的焦點。最新的研究表明大蒜苗能夠通過改變APTT、PT、TT、FIB含量而發(fā)揮抗凝血作用[8-9]，揭示了蔥屬抗凝血活性的潛能[10]。

大蒜油是一種辛辣味的揮發(fā)油，具有多種生理活性，還有抗腫瘤[11]、抗癌[12]、抗動脈粥樣硬化[13]、抗血栓[14]、抗糖尿病[15]、抗血小板聚集[16-17]、抗炎[18]、降血脂[19]等多種藥理作用。大蒜油成分主要以硫醚類（二烯丙基硫醚（allyl sulfide，DAS）、二烯丙基二硫醚（allyl disulfide，DADS）、二烯丙基三硫醚（allyl trisulfide，DATS）為主，還包括少量的噻吩類阿霍烯類[20]等。以硫醚為代表的脂溶性硫化物在抗凝血方面的研究還鮮有報道。本研究從大蒜中分離提取大蒜油，通過紫外光譜、分子熒光光譜、動力學(xué)分析等探究大蒜油及其主要成分的抗凝血作用，旨在為大蒜油抗凝血功能的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

48 只6～8 周齡SD大鼠，平均體質(zhì)量為（220.0±4.5）g，由沈陽陸軍總院動物實驗室提供并飼養(yǎng)，使用許可證號：SYXK（遼）2018-0009。大鼠喂養(yǎng)及干預(yù)期間自由飲水，12 h/12 h明暗周期，動物房溫度為（22±2）℃，相對濕度為（50±10）%。動物處理及飼養(yǎng)條件按照動物福利的相關(guān)規(guī)定及《中華人民共和國實驗動物管理條例》和《實驗動物質(zhì)量管理辦法》實施。

大蒜 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)貿(mào)市場；凝血酶 安徽經(jīng)科公司；凝血酶發(fā)色底物S2238 上海源葉公司；DAS、DADS、DATS 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品化學(xué)實驗室；谷胱甘肽（glutathione，GSH）檢測試劑盒、谷胱甘肽還原酶（glutathion reductase，GR）試劑盒、總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）試劑盒、總蛋白（total protein，TP）定量試劑盒 南京建成研究所；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1810紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；F-4600熒光光譜儀 日本Hitachi公司；7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent公司；CA1500全自動血凝分析儀 日本SYSMEX公司。

1.3 方法

1.3.1 大蒜油的制備

參考文獻(xiàn)[21]制備大蒜油。200 g大蒜加入200 mL蒸餾水，勻漿2～3 min并37 ℃攪拌4 h，令蒜氨酸酶與底物接觸，使脂溶性硫化物充分形成。含有大蒜油的溶液進(jìn)一步加熱至沸騰，經(jīng)冷凝管后形成油-水混合物餾出，靜置分層取油相，得到大蒜油。

1.3.2 大蒜油氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析

地方政府官員微博不僅要及時公布自己的行程，讓網(wǎng)民了解官員的日常生活狀態(tài)，知道官員都干了些什么，還要將自己職權(quán)范圍內(nèi)可以公開的所在機(jī)構(gòu)的最新動向公布到微博上，使網(wǎng)民更好地了解這些部門的工作情況。在表達(dá)個人意見和觀點的同時，官員要準(zhǔn)確把握官員個人和公職身份之間的關(guān)系，避免發(fā)布與自身身份相沖突的個性化觀點，特別要注意不能挑戰(zhàn)社會常識和倫理底線。官員應(yīng)了解民眾的需求，敢說敢言，面對網(wǎng)友的質(zhì)疑應(yīng)積極應(yīng)對，多做解釋，盡量避免與網(wǎng)友的激烈爭辯，在無法解決問題時，政府官員應(yīng)主動“休戰(zhàn)”，做到求同存異。

參考文獻(xiàn)[22]，用乙酸乙酯溶液配制大蒜油劑量為10 μL/mL的混合液體，經(jīng)0.22 μm過濾膜過濾后進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析。色譜柱：DB-17MS（30 m×0.25 μm）；進(jìn)樣量：1 μL；分流比：1∶50；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；檢測器溫度：250 ℃；載氣：He（純度99.999%）；流速：4.0 mL/min；電子轟擊離子源：70 eV；離子源溫度：30 ℃；四極桿溫度：450 ℃；升溫程序：90 ℃保持1 min后以13 ℃/min速率升溫至250 ℃，保持3 min。

1.3.3 凝血酶活力測定

參考文獻(xiàn)[23]測定凝血酶活力。大蒜油原液、DAS、DADS、DATS經(jīng)2%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇溶液溶解，其中大蒜油原液分別稀釋102、103、104倍，DAS、DADS、DATS分別制成濃度為1.0、2.5、5.0 mmol/L溶液，將上述液體分別與質(zhì)量濃度為1 mg/mL的凝血酶溶液以1∶1（V/V）混勻，37 ℃放置30 min，作為酶處理液。

凝血酶活力檢測體系（3 mL）：0.2 mL凝血酶發(fā)色底物S2238（1 mmol/L）、10 μL酶處理液，用0.1 mol/L pH 8.4 Tris-HCl緩沖液補(bǔ)足至3 mL，以10 s為間隔，記錄405 nm波長處吸光度，吸光度越高，酶活力越強(qiáng)。

1.3.4 分子熒光光譜分析

凝血酶（4 mg/mL、0.2 mL）分別與大蒜油、DAS、DADS、DATS（5 mmol/L、0.2 mL）以1∶1（V/V）混勻，37 ℃水浴30 min，激發(fā)波長280 nm，掃描300～800 nm處的熒光光譜。

1.3.5 分子對接

1.3.6 動物分組和血液樣本采集

參考文獻(xiàn)[25-26]進(jìn)行分組和注射操作。將大鼠隨機(jī)分成6 組，每組8 只，包括空白組、對照組（橄欖油）、大蒜油組、DAS組、DADS組和DATS組。以100 μmol/（kgmb·d）劑量對大鼠連續(xù)3 d進(jìn)行腹腔注射，第4天進(jìn)行頸動脈采血，進(jìn)行抗凝血指標(biāo)（凝血四項）的檢測，剩余血液樣品于-80 ℃保存，用于抗氧化指標(biāo)的測定。

1.3.7 凝血四項的檢測

采用全自動血凝儀分析凝血四項（PT、TT、APTT、FIB質(zhì)量濃度）：將0.3 mL濃度為1.109 mmol/L枸緣酸鈉溶液與0.3 mL待測血液樣品混合，10 000 r/min離心15 min，離心后取血漿檢測凝血四項。

1.3.8 抗氧化指標(biāo)測定

將血液樣品以10 000 r/min離心10 min得到血清，分別用GSH、GR、TP、T-AOC試劑盒測定抗氧化指標(biāo)GSH、GR、TP、T-AOC水平。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Origin 8.5軟件繪圖，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，結(jié)果進(jìn)行正態(tài)性和方差同質(zhì)性檢驗，采用t檢驗進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 大蒜油氣相色譜質(zhì)-譜聯(lián)用分析結(jié)果

如圖1所示，大蒜油分別在6.5、8.5、10.3 min處存在3 個色譜峰，經(jīng)面積歸一化分析，總硫醚含量大于90%。定性分析可以看出，質(zhì)荷比（m/z）41、73、114、146、178是主要碎片。m/z114（Ma）、m/z146（Mb）和m/z178（Mc）分別為DAS（C6H10S，114.21）、DADS（C6H10S2，146.26）和DATS（C6H10S3，178.33）的分子離子碎片。m/z41（對應(yīng)CH2＝CH-CH2-）和m/z73（對應(yīng)CH2＝CH-CH2-S-）是以上3 種物質(zhì)的共有碎片[27]。

圖1 大蒜油總離子流圖及質(zhì)譜圖Fig.1 Total ion current chromatogram and mass spectrum of crude garlic oil

2.2 大蒜油、DAS、DADS、DATS對凝血酶活性的影響

大蒜及其不同的制劑可以抑制交原刺激的血小板聚集，表現(xiàn)出抗凝血作用[28]。如圖2所示，本研究利用大蒜油、DAS、DADS、DATS與凝血酶進(jìn)行相互作用后檢測凝血酶活性的變化，不同濃度硫化物對凝血酶活性有部分抑制作用，且存在濃度依賴關(guān)系，濃度越高，活性抑制越強(qiáng)。進(jìn)一步以DAS、DADS、DATS與凝血酶作用，1～5 mmol/L濃度范圍均對酶活性起到部分抑制效果，其中DATS作用最強(qiáng)，DADS次之，DAS最弱（圖2B～D）。

圖2 大蒜油（A）、DAS（B）、DADS（C）、DATS（D）對凝血酶活性的影響Fig.2 Effects of garlic oil (A), DAS (B), DADS (C) and DATS (D) on thrombin activity

2.3 酶動力學(xué)分析結(jié)果

利用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法進(jìn)行酶動力學(xué)分析，結(jié)果如圖3所示，經(jīng)DAS、DADS、DATS處理的凝血酶，Vmax和Km同時發(fā)生變化，將直線交點不在橫坐標(biāo)軸上和縱坐標(biāo)軸上的情況判定為混合型抑制（或共同型抑制）[29-30]，說明該抑制作用屬于競爭性和非競爭性的共同型抑制。這意味兩種作用方式產(chǎn)生抑制：即與底物競爭酶結(jié)合部位方式以及與酶的非活性部位結(jié)合形成抑制物-酶復(fù)合物的方式，不影響酶與底物的再次結(jié)合[29-30]。

圖3 DAS（A）、DADS（B）、DATS（C）酶動力學(xué)Lineweaver-Burk圖Fig.3 Lineweaver-Burk plots for DAS (A), DADS (B) and DATS (C)

2.4 熒光分析及分子對接分析結(jié)果

Trp、Tyr、Phe在300～400 nm波長處熒光變化可以反映蛋白質(zhì)周圍環(huán)境變化導(dǎo)致的立體結(jié)構(gòu)改變[31]。如圖4A所示，處理后的凝血酶，346 nm波長處處熒光強(qiáng)度降低，且位置和峰形不變，說明大蒜油、DAS、DADS、DATS都能不同程度地與酶發(fā)生作用，結(jié)合圖2分析可知，大蒜油中起到酶活性抑制的物質(zhì)主要是DADS和DATS，它們單獨的作用效果要優(yōu)于大蒜油和DAS單獨作用的效果。如圖4B所示，隨著DATS濃度增加，346 nm波長處熒光強(qiáng)度逐漸降低，說明DATS與酶蛋白中發(fā)色基團(tuán)相互作用發(fā)生熒光猝滅。在本實驗條件下，大蒜油、DAS、DADS、DATS本身無熒光。

進(jìn)一步利用分子對接技術(shù)深入探討DATS對凝血酶三維結(jié)構(gòu)[PDBID：1ETT]相互作用機(jī)制。利用三維分子對接技術(shù)，DATS與凝血酶的結(jié)合能為-4.55 kJ/mol，屬自發(fā)反應(yīng)，結(jié)合性能良好（圖4C）。利用二維分子對接技術(shù)，DATS中心位置的硫原子能與酶分子活性位點氨基酸殘基Asp189、Gly219和Ala190中的氧原子形成氫鍵，鍵長分別為3.06、3.11 ?和2.97 ?，與活性位點氨基酸殘基Gly216、Ser195、Trp215形成疏水作用力（圖4D），以上氫鍵及疏水作用力提供了競爭性抑制。DATS與酶分子非活性位點周圍的Gly226、Asp221A、Tyr225、Glu217、Cys191、Val213形成疏水作用力（圖4D），提供了非競爭性抑制[32-33]。分子對接結(jié)果與動力學(xué)結(jié)果一致。

圖4 大蒜油、DAS、DADS、DATS與凝血酶的作用機(jī)制Fig.4 Action mechanisms of garlic oil, DAS, DADS and DATS on thrombin

2.5 大鼠體內(nèi)實驗分析結(jié)果

2.5.1 凝血四項指標(biāo)分析結(jié)果

如表1所示，與空白組相比，大蒜油、DAS、DADS、DATS處理組的PT、APTT和TT均出現(xiàn)顯著增高的趨勢，其中DATS組極顯著升高（P＜0.01），說明大蒜油、DAS、DADS、DATS均是通過改變內(nèi)源性（APTT）、外源性（PT）、共同凝血途徑（TT）凝血系統(tǒng)而起到抗凝作用；大蒜油、DAS、DADS、DATS組FIB質(zhì)量濃度極顯著下降，分別從（2.13±0.66）g/L降低至（1.48±0.23）、（1.54±0.48）、（1.31±0.35）、（1.16±0.13）g/L，說明大蒜油、DAS、DADS和DATS干預(yù)可以降低大鼠血液FIB含量從而發(fā)揮抗凝血活性。綜合圖2和圖3結(jié)果可知DADS和DATS是大蒜油中主要的抗凝血硫化物，且DATS的抗凝血效果更優(yōu)于DADS。

表1 大蒜油、DAS、DADS、DATS對大鼠凝血四項的影響Table 1 Effects of garlic oil, DAS, DADS and DATS on blood coagulation parameters in rats

2.5.2 抗氧化與抗凝血能力

如圖5所示，大蒜油、DAS、DADS、DATS處理組的GSH、GR、TP、T-AOC水平均比空白組略有升高，但都不具有顯著性差異（P＞0.05）。這說明大蒜油、DAS、DADS、DATS只有微弱的抗氧化能力，與大蒜油、DAS、DADS、DATS具有顯著抗凝血能力的結(jié)果并不一致。因此，本實驗所揭示的大蒜油、DAS、DADS、DATS抗凝血能力應(yīng)該與其抗氧化能力無關(guān)。

圖5 大蒜油、DAS、DADS、DATS對大鼠血清抗氧化指標(biāo)的影響Fig.5 Effects of garlic oil, DAS, DADS and DATS on serum antioxidant indexes of rats

3 結(jié) 論

本研究通過體內(nèi)和體外實驗探索了大蒜油、DAS、DADS、DATS的抗凝血功能，紫外光譜、分子熒光光譜、動力學(xué)分析結(jié)果表明DAS、DADS、DATS對凝血酶的抑制作用屬于競爭性/非競爭的共同抑制效果；二維、三維分子對接分析結(jié)果表明抑制屬競爭性和非競爭抑制并存的作用方式；大鼠凝血四項的結(jié)果從體內(nèi)的角度印證了大蒜油、DAS、DADS、DATS具有抗凝血功能；大鼠抗氧化實驗結(jié)果提示大蒜硫醚類抗凝血功能應(yīng)與抗氧化能力不相關(guān)。