尚德靜, 趙 蕾*， 王 野*， 姜鳳全,2

(1.遼寧師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連 116081； 2.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 檢驗(yàn)科，遼寧 大連 116011)

糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)作為一種條件致病菌，容易形成保護(hù)性生物被膜，引起多種慢性感染，例如：感染性心內(nèi)膜炎、尿路感染、傷口感染等，是引起醫(yī)院內(nèi)獲得性感染的主要病原菌之一[1-2].隨著抗生素的廣泛使用，糞腸球菌對(duì)臨床上常用的多種抗生素，如帕拉西林、四環(huán)素、左氧氟沙星、阿奇霉素等都產(chǎn)生了耐藥性，糞腸球菌耐藥性的產(chǎn)生給醫(yī)學(xué)界帶來(lái)了重大挑戰(zhàn)[3].生物被膜主要由胞外蛋白、胞外DNA(eDNA)和胞外多糖(EPS)等組成，保護(hù)細(xì)菌免受洗滌劑、抗菌劑和環(huán)境壓力的影響，使細(xì)菌對(duì)抗生素治療的抗藥性提高10～1 000倍.美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health)估計(jì)，多達(dá)80%的細(xì)菌感染與生物被膜有關(guān)，這極大地增加了發(fā)病率和死亡率[4-5].目前認(rèn)為糞腸球菌生物被膜的形成受其群體感應(yīng)系統(tǒng)(Quorum sensing，QS)的調(diào)控[6].QS是細(xì)菌間一種通信系統(tǒng)，即細(xì)菌通過(guò)可擴(kuò)散的小分子信號(hào)感知細(xì)胞群體的密度，從而導(dǎo)致細(xì)菌群體中某些特定基因的協(xié)同表達(dá)[7-8].目前研究發(fā)現(xiàn)糞腸球菌QS中fsr毒力因子調(diào)節(jié)系統(tǒng)可通過(guò)調(diào)節(jié)明膠酶(gelE)等毒力因子的表達(dá)調(diào)節(jié)生物被膜的形成和發(fā)展[9].Fsr信號(hào)系統(tǒng)編碼基因(fsrA、fsrB、fsrC和fsrD)位于gelE的上游，其中,fsrA、fsrB、fsrC與gelE的生成有直接關(guān)系.有研究人員將DNA片段整合到糞腸球菌V583的衍生突變體的fsr位點(diǎn)上，發(fā)現(xiàn)可以抑制gelE的活性，并阻止了生物被膜的形成[10-12].抗菌肽(Antimicrobial peptides, AMPs)是生物體先天免疫的主要成分之一，由10～50個(gè)氨基酸構(gòu)成，具有分子量小、帶3～5個(gè)正電荷、廣譜抗菌等特點(diǎn)[13]，多數(shù)陽(yáng)離子抗菌肽在膜環(huán)境中能形成兩親性的α-螺旋結(jié)構(gòu)[14-15].細(xì)菌細(xì)胞膜中含有帶負(fù)電荷的磷脂，因此帶正電荷的抗菌肽可以通過(guò)靜電作用與帶負(fù)電荷的細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)合，并通過(guò)其特有的兩親性α-螺旋結(jié)構(gòu)插入膜的疏水區(qū)域，引起膜的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)位置的變化，進(jìn)而破壞了細(xì)胞膜的完整性和穩(wěn)定性，內(nèi)容物流出，造成細(xì)菌死亡[16-18].抗菌肽這種獨(dú)特的靶向細(xì)菌膜系統(tǒng)的殺菌機(jī)制也使得細(xì)菌不易產(chǎn)生耐藥性[19-20]，使其最有希望成為取代抗生素的新型抗菌藥物[21-22].本實(shí)驗(yàn)室前期從中國(guó)林蛙(Ranachensinensis)皮膚分泌物中分離純化了天然抗菌肽Temporin-1CEb，并以此為模板，通過(guò)氨基酸替換、增加等方式，設(shè)計(jì)合成了抗菌肽LK-6.并在LK-6的基礎(chǔ)上，將不同位置上的亮氨酸(Leu)和異亮氨酸(Ile)替換成色氨酸(Trp)，合成了含色氨酸系列抗菌肽(Trp-containing antimicrobial peptides).Trp的疏水性較強(qiáng)，與其他抗菌肽相比，含Trp的抗菌肽更容易插入磷脂雙分子層中，使含色氨酸系列抗菌肽的抗菌活性顯著增強(qiáng)[23].本文旨在研究含色氨酸系列抗菌肽對(duì)多藥耐藥糞腸球菌(Multiple-drug resistantEnterococcusfaecalis, MREF)的抗菌活性，并從細(xì)菌內(nèi)外膜系統(tǒng)、QS調(diào)控的生物被膜(Biofilm)和毒性因子等方面對(duì)抗菌肽的作用機(jī)制進(jìn)行了研究，為研發(fā)新型抗菌藥物提供理論依據(jù).

1 材料和方法

1.1 材料

含色氨酸系列抗菌肽由寧波康貝生化有限公司(寧波，浙江)用標(biāo)準(zhǔn)多肽Fmoc固相合成法合成，多肽的純度大于95%，經(jīng)反相高效液相色譜(RT-HPLC)和MALDI-TOF質(zhì)譜檢測(cè)其分子量和純度；多藥耐藥糞腸球菌MREF0321株是從臨床樣本中分離鑒定的菌株，由大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供；2.5%(體積分?jǐn)?shù))戊二醛、無(wú)水乙醇、PBS緩沖液、牛肉膏、蛋白胨和氯化鈉等實(shí)驗(yàn)室常用試劑購(gòu)于Aobox Biotechnology公司(北京)；培養(yǎng)皿、濾膜、注射器、涂布棒、酒精燈、移液槍、96孔板等實(shí)驗(yàn)室常用材料購(gòu)于上海玉博生物科技有限公司 (上海)；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和qPCR試劑盒購(gòu)于寶生物工程有限公司(大連)；NPN(N-phenyl-1-naphthylamine)購(gòu)于Sigma公司(上海)；DiSC3-5購(gòu)于Solarbio公司(北京).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 最小抑菌濃度(MIC)測(cè)定

細(xì)菌37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，稀釋到2×105CFU/mL.取50 μL菌懸液加入96孔板中，加入50 μL不同濃度的抗菌肽在37 ℃孵育18 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD600值.無(wú)菌水和LB液體培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，菌懸液和無(wú)菌水作為陰性對(duì)照，抗菌肽和LB液體培養(yǎng)基作為陽(yáng)性對(duì)照，根據(jù)公式計(jì)算細(xì)菌的存活率：

存活率(%)=OD600{(菌+肽)-(LB+肽)}/{(菌+水)-(LB+水)}×100%.

MIC定義為存活率<5%時(shí)的抗菌肽濃度.

1.2.2 殺菌動(dòng)力學(xué)(Time-killcurve)

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)菌(1×105CFU/mL)中分別加入終濃度為1×MIC、4×MIC、8×MIC和16×MIC的抗菌肽，37 ℃震蕩培養(yǎng).分別在培養(yǎng)10、30、60、90、120、180和240 min時(shí)，取培養(yǎng)物離心(4 000 r/min)10 min.洗去藥物，將樣品稀釋到適當(dāng)?shù)臐舛群?，? mL稀釋液涂在LB瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，次日記錄平板上的細(xì)菌菌落數(shù).菌懸液和無(wú)菌水作為對(duì)照.

1.2.3 掃描電子顯微鏡觀察細(xì)菌形態(tài)

500 μL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)菌(1×105CFU/mL)中分別加入500 μL終濃度為1×MIC和2×MIC的抗菌肽，37 ℃震蕩培養(yǎng)1 h后，用PBS緩沖液洗滌細(xì)菌培養(yǎng)物2次，再用2.5%(體積分?jǐn)?shù))戊二醛4 ℃固定12 h.固定后用30%、50%、70%、80%、90%和100%(體積分?jǐn)?shù))乙醇依次進(jìn)行梯度脫水，每次15 min，自然干燥，噴金后，利用掃描電子顯微鏡觀察.菌懸液和無(wú)菌水作為對(duì)照.

1.2.4 激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)菌細(xì)胞膜完整性

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)菌(1×105CFU/mL)中分別加入終濃度為1×MIC、4×MIC的抗菌肽，37 ℃震蕩培養(yǎng)1 h后，離心10 min，用PBS清洗3次，每次10 min，得到樣品.將染料PI與SYTO9等比例混合，制成染色液.取1 mL染色液加入樣品中，37 ℃避光染色0.5 h后離心，并用PBS清洗3次后，滴在載玻片上，用防淬滅液固定后，用透明指甲油封片，最后用激光共聚焦顯微鏡觀察(SYTO9激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)為485/530 nm，PI激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)為485/630 nm).菌懸液和無(wú)菌水作為陰性對(duì)照，多黏菌素B(polyB)作為陽(yáng)性對(duì)照.

1.2.5 Zeta電勢(shì)檢測(cè)細(xì)菌表面的膜電位

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌懸液離心(3 000 r/min)10 min，用PBS緩沖液將細(xì)菌進(jìn)行重懸，并稀釋到1×105CFU/mL備用.1 mL菌稀釋液中分別加入10 μL不同濃度的抗菌肽，混勻，37 ℃培養(yǎng)5 min.取60 μL混合培養(yǎng)物用Zeta電位分析儀測(cè)定細(xì)菌表面膜電位.菌懸液和無(wú)菌水作為陰性對(duì)照，polyB作為陽(yáng)性對(duì)照.

1.2.6 細(xì)菌外膜滲透性測(cè)定

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌懸液離心(3 000 r/min)10 min，用緩沖液(5 mM HEPES, 1 mM NaN3)清洗2次后重懸細(xì)菌，并稀釋到1×105CFU/mL備用.染料NPN用甲醇配成濃度為10 μM的溶液.在96孔板中加入90 μL菌液和20 μL NPN溶液，混勻，加入10 μL不同濃度的抗菌肽，37 ℃培養(yǎng)1 h，用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度的變化(激發(fā)波長(zhǎng)350 nm，發(fā)射波長(zhǎng)420 nm).菌懸液和無(wú)菌水作為陰性對(duì)照，polyB作為陽(yáng)性對(duì)照.

1.2.7 細(xì)菌內(nèi)膜去極化測(cè)定

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌懸液離心(3 000 r/min)10 min，用緩沖液A(5 mM HEPES，20 mM葡萄糖)清洗2次.用緩沖液B(5 mM HEPES，20 mM葡萄糖，100 mM KCl, pH=7.4)重懸細(xì)菌，并稀釋到1×105CFU/mL備用.在96孔板中加入90 μL菌懸液和10 μL終濃度為4 μM的 DiSC3-5熒光染料，用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)622 nm, 發(fā)射波長(zhǎng)670 nm)，直到DiSC3-5達(dá)到最大吸收，分別加入終濃度為1×MIC、2×MIC、4×MIC的抗菌肽，用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)622 nm, 發(fā)射波長(zhǎng)670 nm).菌懸液和無(wú)菌水作為陰性對(duì)照，polyB作為陽(yáng)性對(duì)照.

1.2.8 細(xì)菌生物被膜形成的測(cè)定

取50 μL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌懸液(2×105CFU/mL)加入96孔板中，加入50 μL不同濃度的抗菌肽，在37 ℃孵育24 h后，輕輕除去上清液，并用PBS清洗2次，加入甲醇作用15 min，用0.1% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))結(jié)晶紫染色5 min，用清水洗凈，再在每個(gè)孔中加入100 μL 95%(體積分?jǐn)?shù))乙醇，振蕩30 min后，用酶標(biāo)儀測(cè)OD590.對(duì)照組是菌懸液和無(wú)菌水.

生物被膜生成量計(jì)算公式：

生物被膜生物量=OD590(加藥)/OD590(對(duì)照).

MBIC50被定義為50%的生物被膜被抑制時(shí)的抗菌肽濃度，將濃度轉(zhuǎn)換成log值作為X值，抑制率作為Y值，帶入graphpad prism 軟件計(jì)算.

1.2.9 細(xì)菌生物被膜分解的測(cè)定

取50 μL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌懸液(2×105CFU/mL)加入96孔板中，加入50 μL LB培養(yǎng)基，37 ℃孵育24 h后，將上清液倒掉，分別加入50 μL不同濃度的抗菌肽，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，輕輕去掉上清液，用PBS洗后加入甲醇靜置15 min，然后用0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))結(jié)晶紫染色5 min，用清水洗凈加入100 μL 95%(體積分?jǐn)?shù))乙醇，振蕩培養(yǎng)30 min，用酶標(biāo)儀測(cè)OD590.對(duì)照組是菌懸液和無(wú)菌水.

生物被膜生成量計(jì)算公式：

生物被膜生物量=OD590(加藥)/OD590(對(duì)照).

MBRC50被定義為50%的生物被膜被分解時(shí)的抗菌肽濃度，將濃度轉(zhuǎn)換成log值作為X值，分解率作為Y值，帶入graphpad prism 軟件計(jì)算.

1.2.10 細(xì)菌生物被膜組分EPS含量的測(cè)定

取50 μL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌懸液(2×105CFU/mL)加入96孔板中，加入50 μL不同濃度的抗菌肽，37 ℃孵育24 h后離心(10 000 r/min)15 min，然后將沉淀重懸于高鹽緩沖液，再次離心(10 000 r/min)30 min，取上清液與三體積的冷乙醇混合，4 ℃溫育過(guò)夜后加入提前預(yù)冷的苯酚和H2SO4混合物中，用酶標(biāo)儀測(cè)OD490.對(duì)照組是菌懸液和無(wú)菌水.

1.2.11 細(xì)菌生物被膜組分eDNA含量的測(cè)定

取50 μL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌懸液(2×105CFU/mL)加入Ep管中，加入50 μL不同濃度的抗菌肽，37 ℃孵育24 h后通過(guò)孔徑為0.22 μm的濾膜進(jìn)行過(guò)濾去除細(xì)菌.取90 μL濾液加入96孔板中，用酶標(biāo)儀測(cè)OD260.對(duì)照組是菌懸液和無(wú)菌水.

1.2.12 RT-qPCR檢測(cè)明膠酶相關(guān)基因表達(dá)

取1 mL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌懸液(1×105CFU/mL)加入Ep管中，分別加入終濃度為1/4×MIC、1/2×MIC的抗菌肽，37 ℃孵育24 h后離心(10 000 r/min)15 min，在沉淀中加入20 μL 10 mg/mL的溶菌酶，37 ℃水浴鍋靜置45 min后，提取細(xì)菌總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行RT-qPCR實(shí)驗(yàn). RT-qPCR反應(yīng)體系為20 μL，包括10 μL 2×SYBR Premix Ex TaqⅡ，0.8 μL正反向引物，2 μL樣品，6.4 μL ddH2O.反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性30 s,94 ℃5 s,55 ℃15 s,72 ℃10 s,循環(huán)40次，延伸30 s.對(duì)照組是菌懸液和無(wú)菌水.16SrRNA用作內(nèi)參，基因定量通過(guò)內(nèi)參基因歸一化表示.RT-qPCR的結(jié)果用比較循環(huán)閾值(Cycle threshold，Ct)表示，Ct值計(jì)算公式：

ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因,

ΔΔCt=ΔCt-Ctcontrol,n=2-ΔΔCt.

引物16SrRNA、fsrA、fsrB、fsrC、gelE基因由上海生工生物工程公司合成，其序列如表1所示.

2012—2015年寶清縣節(jié)水增糧行動(dòng)旱田項(xiàng)目區(qū)由35個(gè)片區(qū)組成，總面積 15.10萬(wàn)畝 （15畝=1 hm2，下同），其中中心支軸式噴灌面積7.49萬(wàn)畝，絞盤式噴灌面積3.91萬(wàn)畝，滴灌面積3.70萬(wàn)畝?？傆盟繛?49.46萬(wàn)m3/a，全部為地下水。項(xiàng)目區(qū)共新建水源機(jī)井558眼，根據(jù)項(xiàng)目區(qū)水文地質(zhì)條件的差異，確定設(shè)計(jì)成井深度為60～80 m，單井設(shè)計(jì)出水量為30～80 m3/h，靜水位埋深 4～32 m。 布井間距 300～400 m，井徑 300 mm。

表1 引物序列

1.2.13 檢測(cè)細(xì)菌明膠酶活性

取50 μL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌懸液(2×105CFU/mL)加入Ep管中，加入50 μL不同濃度的抗菌肽，37 ℃孵育24 h后離心(10 000 r/min)15 min，上清即為測(cè)試樣品.配置濃度為2%(體積分?jǐn)?shù))的偶氮骨膠原溶液，將上清液和偶氮骨膠原溶液加入96孔板中，37 ℃培養(yǎng)1 h后，用酶標(biāo)儀測(cè)OD540.對(duì)照組是菌懸液和無(wú)菌水.明膠酶活性定義為在單位時(shí)間內(nèi)分解偶氮骨膠原的量，計(jì)算公式：

U=ΔOD540/(0.01×t).

其中，U代表酶活力，ΔOD540代表反應(yīng)時(shí)間內(nèi)樣品吸光度值變化量，t代表反應(yīng)時(shí)間.

1.2.14 檢測(cè)細(xì)菌自溶素活性

取50 μL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌懸液(2×105CFU/mL)加入Ep管中，加入50 μL不同濃度的抗菌肽，37 ℃孵育24 h后離心(10 000 r/min)15 min，上清即為測(cè)試樣品.配置肽聚糖底物，將上清液和肽聚糖底物加入96孔板中，37 ℃培養(yǎng)1 h后，用酶標(biāo)儀測(cè)OD450.對(duì)照組是菌懸液和無(wú)菌水.自溶素活性定義為在單位時(shí)間內(nèi)分解肽聚糖的量，計(jì)算公式：

U=ΔOD450/(0.01×t).

其中，U代表酶活力，ΔOD450代表反應(yīng)時(shí)間內(nèi)樣品吸光度值變化量，t代表反應(yīng)時(shí)間.

2 結(jié)果與分析

2.1 含色氨酸系列抗菌肽對(duì)MRFE0321具有高的抗菌活性

含色氨酸系列抗菌肽的相對(duì)分子質(zhì)量、理化性質(zhì)和抗菌活性如表2.從表中可以看出，5個(gè)抗菌肽(I1W、I4W、L5W、L11W和L12W)氨基酸組成相同，都含有1個(gè)Trp殘基，但Trp分別位于氨基端的1、4、5、11和12位點(diǎn)，分子量相同，兩親性和疏水值相似.2個(gè)抗菌肽含有2個(gè)Trp殘基，分子量相同，兩親性和疏水值相似.7種含色氨酸系列抗菌肽對(duì)MREF0321均有較強(qiáng)的抗菌活性，MIC值為1.56～6.25 μM.

表2 含色氨酸系列抗菌肽的生物學(xué)性質(zhì)和抗菌活性

圖1 含色氨酸系列抗菌肽對(duì)MREF0321的殺菌活性

2.2 含色氨酸系列抗菌肽I4W和L5W對(duì)MREF0321外膜和內(nèi)膜的影響

SYTO9與PI是檢測(cè)細(xì)胞膜完整性的兩種染料:SYTO9能夠進(jìn)入具有完整細(xì)胞膜的細(xì)菌內(nèi)，將細(xì)菌染成綠色;而PI無(wú)法通過(guò)完整的細(xì)胞膜，只有當(dāng)細(xì)胞膜被破壞時(shí)，才能夠進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，與細(xì)胞核DNA結(jié)合呈紅色熒光.因此,可以通過(guò)細(xì)菌中紅色或綠色熒光強(qiáng)度的比例判斷細(xì)菌細(xì)胞膜的破壞程度.結(jié)果如圖2所示，對(duì)照組是未處理的正常MREF0321細(xì)胞，均呈綠色熒光.加入I4W或L5W后紅色熒光明顯增多，綠色明顯減少，并且隨著肽濃度的增加，紅色熒光也逐漸增加，綠色熒光逐漸減少，其作用效果與陽(yáng)性對(duì)照polyB的相似.提示I4W和L5W能夠利用破壞MREF0321菌株細(xì)胞膜殺死細(xì)菌.

圖2 激光共聚焦顯微鏡觀察含色氨酸系列抗菌肽對(duì)MREF0321的影響

細(xì)菌表面帶負(fù)電荷，抗菌肽帶正電荷，可以通過(guò)Zeta電勢(shì)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)菌表面的電位變化，說(shuō)明抗菌肽與細(xì)菌的結(jié)合.實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3A所示，加入I4W或L5W后，MREF0321表面電位從負(fù)值逐漸變成0，進(jìn)一步增加到正電勢(shì)，表明MREF0321表面的負(fù)電荷逐漸被I4W或L5W所帶的正電荷中和，而且隨著肽濃度增加，呈正電勢(shì).I4W和L5W分別在濃度為3.13 μM和6.25 μM時(shí)能夠?qū)REF0321細(xì)胞表面的負(fù)電荷完全中和，陽(yáng)性對(duì)照polyB與I4W相似.NPN是一種疏水性的熒光探針，在疏水的條件下會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光，而在水溶液條件下則會(huì)發(fā)生熒光淬滅.當(dāng)細(xì)菌外膜受到破壞時(shí)，NPN熒光染料就會(huì)進(jìn)入外膜的疏水區(qū)域而產(chǎn)生熒光.可以通過(guò)檢測(cè)NPN熒光強(qiáng)度判斷抗菌肽對(duì)細(xì)菌外膜的滲透能力.如圖3B所示，加入I4W或L5W后，細(xì)菌細(xì)胞熒光值明顯升高，而且隨著肽濃度增大，熒光值增加，表明I4W和L5W 能增加MREF0321細(xì)胞外膜滲透性，且呈濃度依賴性.DiSC3-5是一種檢測(cè)細(xì)菌細(xì)胞膜通透性的熒光探針，如果細(xì)胞膜穩(wěn)定性或通透性被破壞，親脂性分子就會(huì)與DiSC3-5緊密結(jié)合，熒光強(qiáng)度隨之上升.熒光值越大說(shuō)明細(xì)胞膜被破壞的程度越大.如圖3C和3D所示，DiSC3-5加入MREF0321溶液后，熒光值開(kāi)始下降，6 min后熒光值不再下降，表明熒光染料達(dá)到最大吸收；第10 min加入I4W和L5W以及陽(yáng)性對(duì)照polyB，1 min后，DiSC3-5熒光迅速釋放，并且肽濃度越大，熒光釋放量越多；在作用6 min時(shí)，I4W和L5W組達(dá)到最大熒光釋放量，說(shuō)明I4W和L5W能夠使細(xì)胞膜發(fā)生去極化，并且具有濃度依賴性.

圖3 含色氨酸系列抗菌肽對(duì)MREF0321細(xì)胞外膜和內(nèi)膜的影響

2.3 含色氨酸系列抗菌肽I4W和L5W對(duì)MREF0321生物被膜的影響

用結(jié)晶紫染色法測(cè)定含色氨酸系列抗菌肽對(duì)MRFE0321生物被膜的形成和分解的影響.如圖4A所示，I4W和L5W明顯抑制MRFE0321生物被膜的形成，并且隨著肽濃度的增大，抑制增加.兩個(gè)肽與polyB的作用效果相似.I4W和L5W的MBIC50值都是5 μM左右，是其MIC值的2～3倍(表3)，表明I4W和L5W能夠抑制 MRFE0321生物被膜的形成，但其在低于MIC濃度時(shí)，抑制效果較差.含色氨酸系列抗菌肽還可以分解已經(jīng)形成1 d的MREF0321生物被膜.如圖4B所示，低濃度的I4W和L5W 對(duì)MREF0321生物被膜的分解較差，當(dāng)肽濃度增加到4×MIC及以上時(shí)，對(duì)MREF0321生物被膜的分解效率明顯提高，分解效果與polyB相似；I4W和L5W的MBRC50值分別是8.65和10.72 μM，是其MIC值的5.5倍和3.4倍(表3)，表明I4W和L5W對(duì)已經(jīng)形成1 d的MREF0321的分解能力低于其對(duì)生物被膜形成的抑制能力.EPS和eDNA是生物被膜的重要組分，在生物被膜形成過(guò)程中發(fā)揮重要的作用.如圖4C和4D所示，加入I4W或L5W后，MREF0321生物被膜中EPS和eDNA的生成量均顯著降低，而且肽濃度越高，二者生成量越少，與陽(yáng)性對(duì)照polyB的作用效果相似.

圖4 含色氨酸系列抗菌肽對(duì)MREF0321生物被膜的影響

表3 含色氨酸系列抗菌肽對(duì)MREF0321生物被膜的MBIC50和MBRC50值

2.4 抗菌肽I4W和L5W調(diào)節(jié)MREF0321 毒性因子的表達(dá)

GelE是糞腸球菌分泌的一種重要毒性因子，其表達(dá)受fsr系統(tǒng)中fsrA、fsrB和fsrC等基因調(diào)節(jié)，可以從轉(zhuǎn)錄水平上檢測(cè)含色氨酸系列抗菌肽對(duì)fsr系統(tǒng)中fsrA、fsrB、fsrC及gelE基因表達(dá)的影響.結(jié)果如圖5A所示，對(duì)照組4個(gè)基因表達(dá)量穩(wěn)定，而加入I4W和L5W后，fsrA、fsrB、fsrC和gelE的表達(dá)均低于對(duì)照組，與陽(yáng)性對(duì)照polyB的作用效果相似.表明I4W和L5W能夠抑制gelE及相關(guān)基因fsrA、fsrB和fsrC的表達(dá)，并且具有濃度依賴性.gelE能夠分解膠原，當(dāng)與偶氮相連的骨膠原被分解后，偶氮染料釋放進(jìn)入溶液中，熒光值即OD540就會(huì)升高，OD540越高，表示gelE活性越強(qiáng).結(jié)果如圖5B所示，對(duì)照組的酶活力為0.96 U，加入I4W或L5W后，酶活力明顯降低，并且肽濃度越高，降低得越多，與陽(yáng)性對(duì)照polyB的作用效果相似，表明I4W和L5W能夠抑制gelE活性，且具有濃度依賴性.GelE還能激活細(xì)菌分泌另一種毒性因子——自溶素，自溶素可以分解肽聚糖.當(dāng)肽聚糖被分解后，吸光值OD450就會(huì)降低，OD450越低，表示自溶素的活性越強(qiáng).結(jié)果如圖5C所示，對(duì)照組的酶活力為0.54 U，加入I4W或L5W后，自溶素活性明顯降低，并且肽濃度越高，降低得越多，與陽(yáng)性對(duì)照polyB的作用效果相似，表明I4W和L5W能夠抑制自溶素活性，且具有濃度依賴性.

圖5 含色氨酸系列抗菌肽對(duì)MREF0123毒性因子的影響

3 討 論

糞腸球菌作為臨床感染中最常見(jiàn)的致病菌，由于其固有性耐藥和獲得性耐藥，已經(jīng)對(duì)多種傳統(tǒng)的抗生素產(chǎn)生了耐藥性，因此迫切需要代替抗生素的新型藥物.隨著人們對(duì)抗菌肽的深入研究以及抗菌肽表現(xiàn)出的諸多優(yōu)點(diǎn)，抗菌肽受到越來(lái)越多的關(guān)注[24].目前為止，國(guó)內(nèi)外學(xué)者提出了關(guān)于抗菌肽機(jī)制的多種可能性，但普遍認(rèn)為帶正電荷的陽(yáng)離子抗菌肽首先通過(guò)靜電作用與細(xì)菌細(xì)胞膜上帶負(fù)電荷的磷脂雙分子層相互作用.隨后抗菌肽的疏水區(qū)域插入疏水的細(xì)胞膜磷脂雙分子層，改變細(xì)胞膜的通透性，細(xì)胞內(nèi)容物外泄，導(dǎo)致細(xì)菌死亡[25].本實(shí)驗(yàn)室從中國(guó)林蛙皮膚分泌物中提取出天然抗菌肽Temporin-1CEb，并對(duì)其進(jìn)行改造.前期研究發(fā)現(xiàn)含色氨酸系列抗菌肽具有較強(qiáng)的疏水性，其特有的側(cè)鏈基團(tuán)有助于抗菌肽插入細(xì)胞膜中，對(duì)銅綠假單胞菌、表皮葡萄球菌等都有良好的抗菌活性.本次研究發(fā)現(xiàn)含色氨酸系列抗菌肽對(duì)MRFF0321具有良好的抗菌活性，且具有濃度依賴和時(shí)間依賴性，其中，抗菌肽I4W的殺菌活性好于L5W.兩者對(duì)細(xì)菌的作用靶點(diǎn)位于膜上，可以通過(guò)靜電作用與細(xì)胞膜結(jié)合改變細(xì)胞外膜和內(nèi)膜的通透性，并擾亂膜穩(wěn)定性，使細(xì)胞內(nèi)容物泄漏，導(dǎo)致細(xì)胞死亡.糞腸球菌在臨床上最常引起的疾病是尿路感染，留置導(dǎo)尿管表面易于細(xì)菌的定植和生物被膜的生成，其通過(guò)植入各種人造裝置侵入人體，在這個(gè)過(guò)程中會(huì)發(fā)生一些表型變化，從而獲得對(duì)抗菌藥物頑強(qiáng)的抵抗力[26-27].造成這種現(xiàn)象的主要原因就是細(xì)菌在這些人造材料表面形成了難以清除的生物被膜，生物被膜是其主要毒力及致病因素[28-29].此次研究還發(fā)現(xiàn)抗菌肽I4W和L5W能夠通過(guò)抑制fsr群體感應(yīng)系統(tǒng)中明膠酶相關(guān)基因fsrA、fsrB、fsrC、gelE的表達(dá)，抑制毒性因子自溶素和明膠酶的生成，最終抑制生物被膜及生物被膜組分EPS和eDNA的生成.國(guó)內(nèi)外的研究進(jìn)展表明，除了大量膜活性抗菌肽外，許多抗菌肽可以干擾或抑制細(xì)胞內(nèi)生物合成過(guò)程，如抗菌肽buforinⅡ和PR39穿過(guò)細(xì)菌的細(xì)胞膜后與核酸作用，最終殺死致病菌[30].另一方面，有其他研究人員發(fā)現(xiàn)，抗菌肽還能夠抑制對(duì)宿主有損傷的炎癥反應(yīng)，抵制而不直接殺死病原體，維持組織體內(nèi)平衡，為治療傳染病提供了新途徑，因此，抗菌肽具有作為新一代抗生素的發(fā)展?jié)摿?迄今為止，在市場(chǎng)上有超過(guò)100種基于肽的藥物用于治療各種疾病，而在臨床試驗(yàn)中幾乎有500～600種候選藥物，其中，許多都是合成型抗菌肽[31].已經(jīng)在臨床使用合成肽的實(shí)例包括用于局部應(yīng)用的多黏菌素[32]，作為局部軟膏和滴眼劑的短桿菌肽[33]，充當(dāng)食品防腐劑的乳鏈菌肽[31].此外，米卡芬凈和阿尼芬凈作為臨床批準(zhǔn)的抗真菌藥物，達(dá)托霉素較早用于皮膚感染，現(xiàn)在最大限度地以注射形式用作抗甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌的備用殺菌藥物[34].因此，深入研究合成肽對(duì)病原微生物的殺傷機(jī)制，能有效評(píng)估抗菌肽在臨床應(yīng)用的潛在價(jià)值，同時(shí)為新藥研發(fā)提供新思路.