李慶偉， 宋曉萌， 逄 越

(1.遼寧師范大學 生命科學學院，遼寧 大連 116081；2.遼寧師范大學 七鰓鰻研究中心，遼寧 大連 116081)

白細胞介素-1(Interleukin-1, IL-1)家族及其相應受體是介導炎癥反應的主要信號分子.IL-1家族成員是一類細胞因子，通過連接先天和后天免疫系統(tǒng)啟動炎癥級聯(lián)反應[1].在哺乳動物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了11個IL-1家族成員[2-3]，根據(jù)其共有序列，可分為3個亞家族：具有促炎活性的分子(IL-1α, IL-1β, IL-18, IL-33, IL-36α, IL-36β和IL-36γ)、天然受體拮抗劑(IL-1Ra, IL-36Ra和IL-38)和抗炎細胞因子(IL-37)[4].

目前，在魚類中僅發(fā)現(xiàn)2個IL-1家族成員：IL-1β和IL-18[5].IL-1β作為一種有效的促炎細胞因子，在哺乳動物機體免疫調控中發(fā)揮著重要作用[6]，是IL-1家族中研究最多的成員.隨著對IL-1β研究的不斷深入，目前已克隆得到多種魚類的IL-1β基因，并利用多種生物學技術對魚類IL-1β的組織表達及功能展開研究.本文從IL-1β的進化、結構、在各組織中分布情況以及生物學功能等方面進行總結，以期為了解魚類IL-1β的結構和功能奠定理論基礎.

1 IL-1β的進化研究

IL-1β最初在人類(Homosapiens)和小鼠(Musmusculus)中被發(fā)現(xiàn)，目前的研究已經(jīng)證實該分子不僅在哺乳動物中存在，還在雞(Gallusgallus)[7]、中華鱉(Pelodiscussinensis)[8]、非洲爪蟾(Xenopuslaevis)[9]等非哺乳動物中存在.1999年，Zou等人采用同源克隆的方法，最早從虹鱒(Oncorhynchusmykiss)中克隆得到IL-1β基因序列[10].到目前為止，已在多種魚類中鑒定出了IL-1β基因，包括虹鱒、草魚(Ctenopharynogodoniddla)[11]、斑點貓鯊(Scyliorhinuscanicula)[12]、鮸魚(Miichthysmiiuy)[13]、海參斑魚(Cyclopteruslumpus)[14]、鯉魚(Cyprinuscarpio)[15-16]、海鱸(Dicentrarchuslabrax)[17]、斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)[18]、太平洋鱈魚(Gadusmacrocephalus)[19]、大黃魚(Larimichthyscrocea)[20]和牙鲆(Paralichthysolivaceus)[21-22]等.

在一些物種中存在一個以上IL-1β基因[15,22].最新的研究表明，在新真骨魚亞群(Neoteleostei)、原棘鰭總目(Protacanthopterygii)以及更高等的魚類中存在兩種不同的IL-1β[14-16,21-26].同一物種的兩種IL-1β基因具有很高的序列一致性，并被認為可能是在特定魚類譜系(如虹鱒魚和鯉魚)或在串聯(lián)基因復制后(如鯰魚)發(fā)生的進一步基因組復制事件的結果[15].通過對基因結構和共線性基因分析比較，將硬骨魚中編碼IL-1β的基因分為兩種類型：Ⅰ型(IL-1β2)和Ⅱ型(IL-1β1)[14,24].

在高等脊椎動物中，IL-1β的側翼基因較為保守.對不同脊椎動物IL-1β基因的共線性分析顯示，魚類IL-1β的連鎖基因與四足動物相比存在較大差異.這一研究表明，基因在染色體上的定位可能與生活條件的變化有關，其中，水環(huán)境被認為是影響脊椎動物進化的重要因素[27].CKAP2L是人類和硬骨魚IL-1β基因座之間唯一的共同基因，與硬骨魚IL-1β1基因緊密連鎖，但在硬骨魚IL-1β2基因座中缺失[24].對于大多數(shù)脊椎動物而言，CKAP2L基因位置鄰近IL-1β基因，這暗示著該基因座可能出現(xiàn)在大約3.1億a前——鳥類和哺乳動物的分化之前[7,13].IL-1β1和IL-1β2基因座之間也存在一定的相似性，例如：與CNNM4和PURB基因的接近度，這表明硬骨魚IL-1β基因是人類IL-1β的直系同源基因，且兩種類型的IL-1β可能起源于硬骨魚特異性的第三輪全基因組復制(3R WGD)[14,23].

人、小鼠和大鼠(Rattusnorvegicus)IL-1Ra、IL-1α和IL-1β基因具有相似的“7外顯子-6內(nèi)含子”結構，這表明基因復制事件可能促進了IL-1家族的產(chǎn)生過程[28-30].Gibson等人指出，在物種形成之前，在其共同祖先中已經(jīng)形成了IL-1家族.當單個物種面臨一系列不同的挑戰(zhàn)時，這些基因可能受到了顯著的選擇性壓力，從而導致它們在基因組中的分散[7].人類第7號染色體上存在一個包含非哺乳動物IL-1β兩側大部分基因的基因座，這與Gibson等人關于IL-1配體基因的進化的觀點相一致.

對于IL-1Ra、IL-1α和IL-1β三者的進化起源關系，目前存在兩種假設：一是IL-1Ra由祖先IL-1基因復制產(chǎn)生而來，對應于兩棲動物出現(xiàn)的時間(3.2～4.0億a前)，而IL-1α和IL-1β的分離則被認為是最近發(fā)生的(2.7～3.0億a前)[28]；二是IL-1α首先從祖先IL-1中復制出來，與IL-1Ra和IL-1β的之間的差異相比，IL-1α與這兩種蛋白質的差異更大.由此推論，IL-1β和IL-1Ra的共同祖先是一個選擇性剪接的基因，該基因產(chǎn)生的一個轉錄本編碼了祖先IL-1β，而另一個轉錄本編碼IL-1Ra.當基因復制事件發(fā)生后，產(chǎn)生了編碼不同產(chǎn)物的兩個基因[28,31].近年來，在軟骨魚等古老的脊椎動物物種中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了IL-1β基因，可以肯定的是，IL-1β的起源很早.

2 魚類IL-1β的結構

成熟的IL-1β蛋白質結構中存在12個β-片層，折疊形成對受體結合至關重要的三葉草狀結構[32].IL-1β的C-末端保守區(qū)域存在一個IL-1家族特征基序：[FC]-xS-[ASLV]-x(2)-Px(2)-[FYLIV]-[LI]-[SCA]-Tx(7)-[LIVM][28](圖1)，該序列跨越IL-1β成熟體的第9～11個β-折疊[23].雞[7]和非洲爪蟾[9]的IL-1β均具有該特征序列，但在硬骨魚和軟骨魚中該特征序列出現(xiàn)細微差異[23].魚類的兩種IL-1β都具有IL-1家族的特征序列和β-三葉草結構.高等脊椎動物的IL-1β由IL1前體結構域和IL1結構域組成，其中,IL1結構域是保守存在的.而在部分魚類和圓口綱物種中缺少IL1前體結構域.有研究指出，IL1前體結構域的功能重要性較低，其唯一作用是阻止與IL-1R1的結合[33]，這解釋了不同物種間IL1前體結構域的同源性遠低于IL1結構域的現(xiàn)象.與其他脊椎動物一樣，魚類的IL-1β缺乏信號肽，目前認為IL-1β通過非經(jīng)典的分泌途徑從細胞中釋放出來[34].

在哺乳動物中，IL-1β以無活性的前體形式產(chǎn)生并存在于細胞質中，炎癥小體激活可導致IL-1β成熟和分泌，以響應各種胞質危險信號[35-36].哺乳動物IL-1β前體經(jīng)Caspase-1特異性切割第5個外顯子中Asp116處的Asp-X鍵(X表示疏水殘基)，形成具有生物學活性的成熟IL-1β[35].Caspase-1(ICE)識別位點在哺乳動物IL-1β序列中嚴格保守，在魚類的相應區(qū)域(如虹鱒IL-1β的第4個外顯子和海鱸IL-1β的第3個外顯子)并未發(fā)現(xiàn)ICE酶切位點[37-39].

Reis等使用定點誘變技術確定了雞IL-1β前體的ICE切割位點為Asp80，海鱸的切割位點為Asp100[40].在斑馬魚(Daniorerio)中，Caspase-1的兩個同系物Caspase A/B具有3個切割位點Asp88、Asp104和Asp122[41]，其中,Asp122對應于海鱸的切割位點，這是存在于所有脊椎動物IL-1β序列的保守天冬氨酸殘基.草魚IL-1β前體在Asn91位置被切割為成熟的IL-1β[11]，對應斑馬魚的Asp88位置.Chen等人發(fā)現(xiàn)大菱鲆(Scophthalmusmaxixus)Caspase切割IL-1β發(fā)生在Asp86處[42](圖1).

此外，IL-1β前體也可以被不同的胞外蛋白酶切割，如膠原酶、組織蛋白酶G、彈性蛋白酶、糜蛋白酶和顆粒酶A等[43-46].這一結果表明，盡管IL-1β裂解位點在不同物種中并不保守，但IL-1β的裂解在其發(fā)揮功能上是相對保守的，這有助于更好地了解硬骨魚類的先天免疫.

第一，運用計劃和市場兩種手段，合理調配研發(fā)資源，提升大學和科研院所的學術型基礎研究能力，同時推動企業(yè)成為產(chǎn)業(yè)驅動型基礎研究的主體。

3 魚類IL-1β的表達譜比較

通過同源克隆或借助細菌、脂多糖(LPS)等刺激以提高轉錄水平，目前已經(jīng)在多種硬骨魚和軟骨魚中發(fā)現(xiàn)并鑒定了IL-1β基因序列.

3.1 魚類IL-1β的組織分布

在大多數(shù)硬骨魚中，IL-1β分子呈現(xiàn)出多組織分布的特點[11,14,19-20,47-56].然而，不同魚類的IL-1β具有不同的組織表達譜(表1).例如，草魚、香魚(Plecoglossusaltivelis)、半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)和重唇魚(Hemibarbuslabeo)的IL-1β在脾、鰓和頭腎中表達量較高[11,49-51]；而在黃鰭金槍魚(Acanthopagruslatus)中，IL-1β在腎臟和脾臟中弱表達，在肝臟、肌肉和心臟中不表達[55].黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)的IL-1β則主要在體腎、血液和心臟中表達[53].在黃鱔(Monopterusalbus)中，IL-1β在腸、脾、肝和腦中有較強的表達，但在肌肉、頭腎、血液和心臟中的表達量較少[47].

在一些魚類中存在多拷貝的IL-1β基因，不同IL-1β亞型的表達組織存在一定的差異.在海參斑魚中，IL-1β1的表達變化很大，在白細胞、頭腎、皮膚黏液以及脾臟中轉錄水平較高，在性腺中最低.而IL-1β2在各組織的表達水平普遍較低，在肝臟中相對最高[14].斑點叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)IL-1β1在肝臟、頭腎、脾臟、腸和肌肉中大量表達，在胃、腦、卵巢、皮膚和體腎中表達量較低.而IL-1β2除了在腦中表達水平較低外，在其他所有受試組織中均勻表達[54].

盡管IL-1β基因在不同魚類中的組織分布模式有所差異，但值得注意的是，魚類IL-1β分子主要在頭腎、脾臟等免疫相關組織以及鰓等黏膜免疫組織中高水平表達，這意味著IL-1β分子在魚類免疫系統(tǒng)中具有重要意義.IL-1β在不同器官中的表達譜的差異可能與不同魚種的免疫細胞系統(tǒng)不同有關，這有待進一步研究.

3.2 魚類IL-1β的刺激應答反應

IL-1β是一種關鍵的炎癥細胞因子，在宿主對病原體感染的免疫反應過程中扮演重要角色.先前的研究顯示，在應對不同的病原體刺激時，魚類IL-1β的表達模式變化呈現(xiàn)明顯的差異(表1).

感染溶藻弧菌(V.alginolyticus)顯著促進了大黃魚各組織中IL-1β基因的轉錄，其中，頭腎和鰓中的轉錄水平變化最為顯著[20]；在感染耶爾森氏菌(Yersiniaruckeri)后，虹鱒脾臟中兩種IL-1β的表達量增加數(shù)千倍[25]；嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)的刺激作用能夠引起黃鱔頭腎和脾臟IL-1β大量表達[47]，提示IL-1β在抗菌反應中的重要作用.嗜水氣單胞菌的刺激可使大鰭鳠(Mystusmacropterus)IL-1β的表達量先上升后降低[59].與之相似的是，在愛德華氏菌(E.ictaluri)刺激后，斑點叉尾鮰頭腎中也出現(xiàn)了類似的趨勢[54]，這表明IL-1β參與魚體內(nèi)的免疫反應，尤其是在抵抗病原體侵染的初期.

脂多糖(LPS)和聚肌胞苷酸(PolyI:C)可作為免疫系統(tǒng)的刺激物，被廣泛用于模擬細菌和病毒感染的刺激，引起魚類體內(nèi)細胞因子的變化.LPS不僅可以刺激誘導軟骨魚IL-1β的表達[12]，也能增加硬骨魚(如重唇魚、黃鰭金槍魚)脾臟、腎臟等組織中IL-1β的表達量[11,13,17-18,51,55].在LPS刺激后，鮸魚各組織中IL-1β的轉錄水平均明顯上調[13]；大口黑鱸(Micropterussalmoides)脾臟中IL-1β mRNA表達水平升高，而在頭腎中無明顯變化[58].不同魚類物種應對LPS刺激產(chǎn)生了類似的應答反應，暗示著在這些魚類中可能存在一種共同的IL-1β調節(jié)機制.研究表明，魚病毒性神經(jīng)壞死病病毒(VNNV)能夠上調金鯧魚(Trachinotusovatus)肝臟、脾臟、腎臟等組織中IL-1β的表達[52].病毒模擬物PolyI:C促進了鮸魚的多種組織中IL-1β表達量增加[13]，但僅略微提高黃鱔頭腎白細胞mRNA表達水平[47].同樣，黑魚(Channaargus)頭腎白細胞IL-1β也可被脂磷壁酸(LTA)、LPS和PolyI:C誘導表達[48].這些結果表明IL-1β在魚類應對細菌和病毒感染過程中行使關鍵功能.

與哺乳動物的胸腺和骨髓構成的中樞免疫系統(tǒng)不同，魚類的免疫相關組織為頭腎、脾臟和血液.致病菌、病毒主要通過皮膚和鰓等途徑感染魚類，隨后傳播到其他內(nèi)臟器官，其中，肝臟、脾臟和腎臟是感染后發(fā)生大量病原體侵入和增殖的主要器官.在多種魚類中，IL-1β在鰓中的轉錄水平顯著高于其他組織[11,20,48,51-52]，經(jīng)病原體刺激后表達量顯著增加，這可能暗示IL-1β在鰓中參與了這些魚的急性炎癥反應.

4 魚類IL-1β的功能研究

IL-1β是一種具有多效性的細胞因子，參與宿主防御微生物入侵、炎癥、免疫應答、代謝調節(jié)、造血過程和腫瘤轉移等一系列反應[1,3-4].IL-1β主要由哺乳動物的單核細胞和巨噬細胞產(chǎn)生[6,61]，也由T細胞、NK細胞、內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、星形膠質細胞、小膠質細胞、腎上腺皮質細胞[62-63]和胰腺β細胞[64]等產(chǎn)生.IL-1β能夠影響重要的細胞功能，例如:降低DNA含量、減少蛋白質合成和細胞內(nèi)能量產(chǎn)生，誘導β細胞凋亡和壞死[3-4].

4.1 IL-1β相關信號通路研究

在哺乳動物中，IL-1β與Ⅰ型受體IL-1R1結合，在受體輔助蛋白IL-1RAP的幫助下募集含有TIR結構域的銜接蛋白MyD88[1-2,65].MyD88向下游傳遞信號激活白介素1受體相關激酶IRAKs和腫瘤壞死因子受體相關因子TRAF6.該信號促進與炎癥和免疫反應相關的關鍵轉錄因子的激活，例如：NF-κB、AP-1、JNK、MAPK和ERK等[1-6,65].

對海參斑魚的轉錄組數(shù)據(jù)分析顯示，NF-κB和MAPK通路的大部分成員在海參斑魚中均已存在[14]，這意味著在魚類中可能存在類似于哺乳動物的信號通路.在細菌刺激后，除了促炎細胞因子(IL-1β、TNF-α和COX-2)外，上調最高的2個分子分別是IκBa和IL-1R2，它們也參與了IL-1β的調節(jié)過程[14].在日本牙鲆中，通過微陣列分析發(fā)現(xiàn)，注射10 μgIL-1β基因的表達載體可誘導其頭腎組織中93個基因的高表達，其中，包括TNF、TLR1、GCSF、MHCⅠ、β2-MG、IgM、CD3、CD20等[21]；在草魚體內(nèi)的研究發(fā)現(xiàn)，重組草魚IL-1β可通過NF-κB和MAPK6信號通路同時上調草魚頭腎白細胞IL-1β和TGF-β1的表達.有研究指出，鯛魚重組IL-1Fm2與PAMP聯(lián)合使用時，能夠激活金頭鯛(Sparusaurata)吞噬細胞的呼吸爆發(fā)并協(xié)同誘導IL-1β的表達[23].此外，海參斑魚nIL-1F能夠抑制IL-1β1的表達，這一現(xiàn)象在草魚中同樣被證明[14,66]，這表明魚類的nIL-1F是一種類似于哺乳動物的IL-1Ra的受體拮抗劑，通過與IL-1R1結合進而阻斷下游信號.目前，魚類IL-1β的功能尚不完全清楚，但它在先天免疫過程中激活吞噬細胞的活性，并且同Toll樣受體(TLR)之間也存在關聯(lián)作用.

4.2 魚類IL-1β的抗菌、殺菌功能研究

到目前為止，大量的研究表明魚類IL-1β參與了病原體感染后的炎癥反應.為了進一步研究IL-1β在魚類中的抗菌、殺菌作用，多種重組魚類IL-1β(rIL-1β)蛋白及抗體被生產(chǎn)出來.

研究發(fā)現(xiàn)：注射IL-1β基因的鯉魚對嗜水氣單胞菌感染的抵抗力增加[67]；虹鱒重組IL-1β蛋白可以誘導體內(nèi)巨噬細胞中COX-2和MHC Ⅱ的表達，腹腔注射僅1 μg rIL-1β即可增強腹腔白細胞的遷移和頭腎巨噬細胞的吞噬功能，從而顯著降低殺鮭氣單胞菌(Aeromonassalmonicida)感染導致的魚類死亡率[68]；重組黑魚IL-1β上調了頭腎白細胞中內(nèi)源性IL-1β的表達，同時在細胞內(nèi)殺菌實驗中顯著降低了細菌的存活率，說明rIL-1β提高了黑魚頭腎白細胞的殺菌能力[48]；重組IL-1β可增強大黃魚對溶藻弧菌的抵抗力，并在體外增加頭腎巨噬細胞的遷移和吞噬活性[20]；在香魚中，抗IL-1β抗體的中和作用降低了頭腎單核/巨噬細胞的殺菌能力，但不改變它們的吞噬功能[49]；在草魚中，抗IL-1β抗體可抑制嗜水氣單胞菌誘導的草魚腸道炎癥[11].

研究證實，注射重組魚類IL-1β可上調魚類內(nèi)源性IL-1β的表達，同時增強單核/巨噬細胞的遷移和吞噬細菌能力；而抗IL-1β抗體降低真核/巨噬細胞的殺菌能力.最近，在大菱鲆中研究顯示，過表達IL-1β抑制了愛德華氏菌(E.ictaluri)在大菱鲆體內(nèi)的定殖，而敲除IL-1β則在早期促進細菌在鰓中的定殖[42].這些研究表明，與哺乳動物IL-1β一樣，魚類IL-1β在抗菌防御中發(fā)揮重要功能，有助于機體抵御細菌感染.

4.3 魚類IL-1β的佐劑效應研究

IL-1β具有廣泛的生物學活性，主要參與調節(jié)炎癥反應和誘導免疫應答.近年來，IL-1β被認為是哺乳動物[69-71]和魚類[54, 72-74]疫苗的潛在免疫刺激劑.基于哺乳動物IL-1β進行序列比對，預測可能的成熟肽.結果顯示，重組硬骨魚IL-1β蛋白具有生物學活性，可引起一系列免疫反應[11,20,48,68].

在斑點叉尾鮰中，rIL-1β1和rIL-1β2蛋白通過提高抗體水平、血清殺菌活性、溶菌酶活性、替代補體溶血活性，增強了聯(lián)合注射疫苗后的免疫應答[54].類似地，將重組IL-1β蛋白與滅活細菌同時注射鯉魚體內(nèi)，可產(chǎn)生更高的抗體凝集水平[73]；在牙鲆中使用重組IL-1β作為佐劑可以提高針對抗原、牛血清白蛋白或綠色熒光蛋白的抗體效價[72].此外，給鯉魚喂食含皂苷(動物的免疫反應和抗體反應的良好佐劑)的豆粕后，IL-1β表達量的上調暗示其參與鯉魚腸中豆粕誘導的腸炎的發(fā)病和恢復[75].

由此可知，魚類IL-1β在免疫調節(jié)過程中發(fā)揮重要作用.重組魚類IL-1β具有促炎性作用，與疫苗聯(lián)合注射后，明顯增加了抗體效價.這表明，魚類IL-1β可作為細菌亞單位疫苗的潛在佐劑，應用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中.

5 總結與展望

IL-1β作為一種促炎細胞因子，廣泛參與魚類體內(nèi)的炎癥和免疫調節(jié)活動.近年來，已經(jīng)在越來越多的魚類中克隆得到IL-1β基因.研究發(fā)現(xiàn)，魚類IL-1β蛋白在結構上與哺乳動物有很多相似性.目前，對魚類IL-1β功能的研究主要集中在病原體刺激后其在轉錄水平上的表達變化.大量的研究表明，魚類IL-1β有助于機體抵御病原微生物的感染.此外，重組魚類IL-1β蛋白可作為很好的佐劑，增強聯(lián)合注射疫苗后的免疫應答.以上結果均表明，魚類IL-1β在免疫調節(jié)過程中扮演著類似哺乳動物IL-1β的重要角色.然而，有關魚類IL-1β功能的研究還不夠深入和全面，仍有很多問題亟待更深入的研究：①IL-1β在魚體中參與炎癥反應的機制以及與哺乳動物信號通路之間的異同；②魚類IL-1β是否參與了其他生命活動，如造血、代謝過程等；③可用于疫苗接種的更多魚類物種的IL-1β.隨著科技的進步和研究的深入，魚類免疫調節(jié)機制等問題將逐漸被解決，這對魚類疾病的防治具有重要意義，并為低等脊椎動物免疫系統(tǒng)的研究提供參考借鑒.