王政露，肖明霞，王乙茹，柳成東，趙 平，錢錦花，楊保和，屈 娥*，程志斌*

（1.云南農業(yè)大學，昆明 650201；2.達州職業(yè)技術學院，四川 達州 635001；3.玉溪農業(yè)職業(yè)技術學院，云南 玉溪 653100；4.云南快大多畜牧科技有限公司，云南 玉溪 653100）

2020年7月1日起，農業(yè)農村部頒布了禁止以促生長為目的的藥物飼料添加劑的使用，因此微生態(tài)制劑等功能性“替抗”飼料添加劑的評估與應用技術受到畜牧行業(yè)的高度關注[1-4]。解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）歸類于芽孢桿菌屬細菌，由于對植物病原菌有較好的抑制作用，因此目前在農業(yè)種植業(yè)中廣泛應用[5-7]。盡管解淀粉芽孢桿菌至今未進入我國飼料添加劑品種目錄，但因其具有良好的耐熱性，適合飼料制粒，近年來在畜禽養(yǎng)殖中的飼用價值評估逐步增多[8-10]。已有動物飼養(yǎng)試驗顯示，飼糧中添加解淀粉芽孢桿菌顯著提高了斷奶仔豬、肉雞的生長性能[9-12]；然而也有報道稱飼用解淀粉芽孢桿菌沒有明顯改善豬雞的生長性能[13-14]。以上飼養(yǎng)試驗報道的矛盾提示：評估飼用微生態(tài)制劑對畜禽生產性能的飼養(yǎng)試驗易受試驗菌株、試驗動物、養(yǎng)殖條件、試驗設計等因素的干擾，試驗結果重復性不穩(wěn)定[15-16]，且動物飼養(yǎng)試驗的周期較長、費用高。因此，建立體外科學、高效的實驗室評估方法與技術，可能更有助于加快解淀粉芽孢桿菌作為飼用益生菌的潛在價值評估。

抑菌性能是飼用微生態(tài)制劑平衡畜禽腸道菌群、促進生產性能的重要機制之一[4]。因此，針對畜禽腸道主要有害菌及有益菌，采用體外抑菌試驗技術評估解淀粉芽孢桿菌的抑菌性能，能夠驗證飼用解淀粉芽孢桿菌在畜禽體內發(fā)揮平衡腸道菌群、促進生長的確切效果。體外牛津杯法是微生態(tài)制劑抑菌作用的最常見評估方法之一[4]，已被用于解淀粉芽孢桿菌抑菌性能的評估[17-19]。然而，現有的報道集中在解淀粉芽孢桿菌對畜禽腸道有害菌的抑制研究[17-20]，對腸道有益菌抑制作用的報道較少[21]，顯然這不利于全面評估解淀粉芽孢桿菌平衡腸道菌群、改善畜禽生產性能的作用。據此，本研究較為系統地開展了解淀粉芽孢桿菌對畜禽腸道主要有害菌及有益菌的抑菌作用評估，以期為解淀粉芽孢桿菌在畜禽生產中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 微生物及指示菌

從云南農業(yè)大學農作物種植基地分離出一株具有降解化學農藥的解淀粉芽孢桿菌，經16S RNA鑒定為解淀粉芽孢桿菌并命名為YNAU 6172，用于本次抑菌試驗評估。

試驗用指示菌包括2 類6 個：（1）腸道有害菌：大腸桿菌K88（Escherichia coliCGMCC1.2385）、大腸桿菌K99（Escherichia coliBNCC125787）、雞白痢沙門氏菌（Salmonella pullorumBNCC124693）、豬霍亂沙門氏菌（Salmonella choleraesuisBNCC186354）；（2）腸道有益菌：羅伊氏乳酸桿菌（Lactobacillu reutreriATCC55730）、嗜熱雙歧桿菌（Bifidobacterium thermophilusATCC25525）。以上菌株購買自北納創(chuàng)聯生物科技有限公司。

1.2 牛津杯抑菌試驗

1.2.1 解淀粉芽孢桿菌及指示菌的培養(yǎng)

（1）LB培養(yǎng)基：酵母膏5.0 g、胰蛋白胨10.0 g、NaCl 10.0 g、蒸餾水1 000 mL。用于培養(yǎng)解淀粉芽孢桿菌及指示菌大腸桿菌K88和大腸桿菌K99、豬霍亂沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌；

（2）MRS培養(yǎng)基：酵母膏10.0 g、蛋白胨20.0 g、NaCl 2.5 g、葡萄糖20.0 g、番茄汁50 mL、磷酸氫二鉀2.0 g、硫酸鎂1.0 g、蒸餾水1 000 mL。用于培養(yǎng)指示菌羅伊氏乳酸桿菌；

（3）BBL 培養(yǎng)基：酵母膏2.0 g、蛋白胨15.0 g、NaCl 5.0 g、葡萄糖20.0 g、番茄粉5.0 g、L-半胱氨酸0.5 g、可溶性淀粉0.5 g、肝浸粉2.0 g、1 mL 吐溫-80、蒸餾水1 000 mL。用于指示菌嗜熱雙歧桿菌的培養(yǎng)。

1.2.2 指示菌涂布平板制備

（1）指示菌大腸桿菌K88 和K99、豬霍亂沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌涂布平板采用LB 培養(yǎng)基，121 ℃滅菌30 min后，冷卻至50 ℃左右倒入培養(yǎng)皿（25～30 mL）。凝固后待水分干燥即可涂布。

（2）指示菌羅伊氏乳酸桿菌和嗜熱雙歧桿菌涂布平板采用MRS培養(yǎng)，121 ℃滅菌30 min后，冷卻至50 ℃左右倒入培養(yǎng)皿（25～30 mL）。凝固后待水分干燥即可涂布。

1.2.3 指示菌液稀釋、涂布

（1）將培養(yǎng)24 h 的大腸桿菌K88 和大腸桿菌K99、雞白痢沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌的中菌液各吸取800 μL，轉入裝有7.2 mL 無菌水的EP 管，進行梯度稀釋至10-3，涂布。每次操作每個指示菌涂3個培養(yǎng)皿（即3次平行測定）。

（2）將培養(yǎng)24 h的羅伊氏乳酸桿菌吸取800 μL，轉入裝有7.2 mL 無菌水的EP 管中，進行梯度稀釋至10-3，涂布。每次操作每個指示菌涂3 個培養(yǎng)皿（即3次平行測定）。

（3）將培養(yǎng)48 h的嗜熱雙歧桿菌吸取發(fā)酵原液進行涂布。每次操作每個指示菌涂3個培養(yǎng)皿（即3次平行測定）。

1.2.4 牛津杯抑菌圈直徑測定

為了評估解淀粉芽孢桿菌對2 類6 個指示菌的抑菌效果，每個指示菌吸取200 μL 涂布一個培養(yǎng)皿，并在每個培養(yǎng)皿中放置1 個牛津杯，向牛津杯加入100 μL 培養(yǎng)24 h 的解淀粉芽孢桿菌菌液。放置恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用游標卡尺測量抑菌圈直徑（Diameter of inhibition zone，DIZ）的最大值與最小值，以二者的平均值確定抑菌圈直徑數據。

1.2.5 抑菌作用的判定方法

關于解淀粉芽孢桿菌抑菌作用，目前尚無統一的判定標準，本研究參考李靜舒等[22]報道的方法，并依據所用牛津杯的直徑（7.8 mm），將牛津杯外徑約2 倍（16.0 mm）區(qū)分為敏感與高敏感。因此抑菌作用判定標準如下：DIZ=7.8 mm，不敏感；7.8 mm＜DIZ≤16.0 mm，敏感；DIZ＞16 mm，高敏感。

1.3 數據分析

以上抑菌試驗重復操作3次，抑菌圈直徑數據采用“平均值±標準誤”表示。

2 結果與分析

2.1 解淀粉芽孢桿菌對畜禽腸道主要有害菌的抑制作用

測定解淀粉芽孢桿菌對畜禽腸道主要有害菌的抑制情況，結果見圖1。結果顯示解淀粉芽孢桿菌對指示菌大腸桿菌K88、大腸桿菌K99、雞白痢沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌的抑制作用均判定為不敏感（DIZ=7.8 mm）。

圖1 解淀粉芽孢桿菌對畜禽腸道主要有害菌的抑制作用情況

2.2 解淀粉芽孢桿菌對畜禽腸道主要有益菌的抑制作用

測定解淀粉芽孢桿菌對畜禽腸道主要有益菌的抑制情況，結果見圖2。

圖2 解淀粉芽孢桿菌對畜禽腸道主要有益菌的抑制情況

解淀粉芽孢桿菌對羅伊氏乳酸桿菌的抑制作用為敏感[DIZ=（11.7±0.6）mm]，對嗜熱雙歧桿菌的抑制作用判定為不敏感。

3 討 論

3.1 解淀粉芽孢桿菌對畜禽腸道主要有害菌的抑制作用

畜禽養(yǎng)殖過程中由于養(yǎng)殖衛(wèi)生環(huán)境的差異，感染不同類型的腸道致病菌易引發(fā)腹瀉等腸道疾病，造成一定的養(yǎng)殖經濟損失。其中，大腸桿菌

K88[23-24]、大腸桿菌K99[23]、豬霍亂沙門氏菌[25]和雞白痢沙門氏菌[26]是豬雞腸道主要的有害致病菌。圖1 顯示，該株解淀粉芽孢桿菌對大腸桿菌K88、大腸桿菌K99、豬霍亂沙門氏菌和雞白痢沙門氏菌等無抑制作用。M.P.Lisboa等[21]最早報道，解淀粉芽孢桿菌（菌株編號LBM5006）對大腸桿菌和沙門氏菌均無抑制作用。R.Scholz 等[17]研究表明，解淀粉芽孢桿菌（菌株編號FZB42）對大腸桿菌沒有抑制作用。董靖等[27]研究也顯示，解淀粉芽孢桿菌（菌株編號HE）對大腸桿菌沒有抑制作用。以上3篇報道與本試驗結果一致。此外，張彤等[28]和夏超篤等[19]通過牛津杯抑菌圖片直觀顯示，解淀粉芽孢桿菌對大腸桿菌和沙門氏菌的抑制作用均為低敏感，這與本試驗結果接近。

然而，付志英等[29]報道，解淀粉芽孢桿菌（菌株編號KHQH-1）對大腸桿菌的抑制作用達到高敏感（DIZ=16.0 mm）。T. Ndlovu 等[18]研究顯示，解淀粉芽孢桿菌（菌株編號ST34)對大腸桿菌（DIZ=18.3 mm）和沙門氏菌（DIZ=25.3 mm）的抑制作用均為高敏感。以上報道與本試驗結果之間差異主要原因可能是解淀粉芽孢桿菌菌株不同，這提示飼用解淀粉芽孢桿菌的研發(fā)需進一步篩選顯著抑制畜禽腸道有害菌的優(yōu)勢菌株，才有助于推動解淀粉芽孢桿菌作為飼用益生菌進入我國飼料添加劑品種目錄，為我國畜牧業(yè)替抗提供更多可選擇的產品及技術方案。

3.2 解淀粉芽孢桿菌對腸道主要有益菌的抑制作用

乳酸桿菌和雙歧桿菌是畜禽腸道優(yōu)勢主要有益菌，對維持畜禽腸道菌群平衡、腸道健康和良好生長性能有重要意義[30-31]。羅伊氏乳酸桿菌是畜禽腸道分布最廣泛、比例最高的乳酸桿菌[31]，嗜熱雙歧桿菌是維持畜禽腸道菌群平衡的重要雙歧桿菌之一[30]。目前，有關解淀粉芽孢桿菌對畜禽腸道有益菌的體外抑菌研究極少。唯一的1篇試驗報道[21]顯示，解淀粉芽孢桿菌對羅伊氏乳酸桿菌有一定的抑制作用（DIZ=9.8 mm），這與本試驗結果基本一致。Teng P.Y.等[32]報道，飼糧添加解淀粉芽孢桿菌組的肉雞盲腸和回腸乳酸桿菌數量，與基礎飼糧組沒有顯著性差異。Cao G.T. 等[33]和 Hong Y.X.等[10]進一步試驗表明，與基礎飼糧組比，飼用解淀粉芽孢桿菌組肉雞盲腸乳酸桿菌的數量顯著降低。以上體內動物試驗檢測腸道菌群的數據與本研究及M.P.Lisboa等[21]體外抑菌試驗結果基本相符。

然而，Lei X. J. 等[12]和楊敏馨[34]在肉雞以及Li X.等[9]在斷奶仔豬中的飼養(yǎng)試驗均發(fā)現，飼糧添加解淀粉芽孢桿菌能夠顯著提高腸道乳酸桿菌數量。結合以上體外抑菌試驗以及飼養(yǎng)試驗腸道菌群報道的諸多矛盾，進一步提示：解淀粉芽孢桿菌菌株的差異可能造成體外及體內抑菌性能的不同，從而最終影響解淀粉芽孢桿菌的飼用價值。

4 結 論

本研究采用體外牛津杯法評估了一株解淀粉芽孢桿菌對畜禽腸道主要有害菌、有益菌的抑制作用。研究顯示，該株解淀粉芽孢桿菌對大腸桿菌K88 及K99、雞白痢沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌等主要腸道有害菌均無抑制作用，且對腸道有益菌羅伊氏乳酸桿菌有一定的抑制作用。以上結果提示，解淀粉芽孢桿菌作為飼用微生態(tài)制劑在畜禽飼糧中的開發(fā)需進一步篩選與謹慎驗證飼喂效果。