王 瑛，張瑩楠，常新捷，張英劍

(河南科技大學第一附屬醫(yī)院 1.兒外科、2.消化內(nèi)科， 河南 洛陽 471000)

壞死性小腸結(jié)腸炎(necrotizing enterocolitis，NEC)是一種常見于早產(chǎn)兒的急性腸道炎癥性疾病，是造成新生兒致殘、致死的重要因素[1]。流行病學調(diào)查統(tǒng)計顯示，在新生兒體質(zhì)量低于1.5 kg的早產(chǎn)兒中NEC發(fā)病率高達7%，致死率高達20%-30%[2]。由于NEC病情的反復性、嚴重性以及復雜性，有關(guān)其確切機制尚不完全清楚。目前研究表明，早產(chǎn)、人工喂養(yǎng)、炎癥風暴等與NEC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3]。細胞焦亡是一種新型的炎癥性、程序性細胞死亡方式，其主要是由caspase-1/3/4/5/11介導GSDMD剪切形成具有細胞毒性的GSDMD-N和無毒性的GSDMD-C，其中GSDMD-N募集至細胞膜與磷脂分子結(jié)合形成GSDMD-N細胞孔洞，促進炎癥細胞因子IL-1β和IL-18釋放，并最終導致機體強烈的炎癥反應(yīng)[4]。在大鼠NEC模型中，細胞焦亡相關(guān)蛋白caspase-1、IL-1β和IL-18表達顯著升高[5]。另外，在小腸上皮細胞中，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)能夠通過促進NLPR3炎癥小體活化誘導細胞焦亡并加快小腸上皮細胞死亡，抑制NLRP3能夠抑制LPS誘導的小腸上皮細胞焦亡，緩解NEC腸道損傷[6]。以上研究均表明，細胞焦亡參與了NEC腸道損傷的病理過程。因此，通過探尋有效藥物調(diào)控細胞焦亡可能成為治療NEC的重要方式。

白藜蘆醇(resveratrol，RSV)是一類存在于葡萄、花生、虎杖等多種植物內(nèi)的多酚類有機化合物。既往研究顯示，RSV具有廣泛的藥理學活性，主要對心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等疾病中的組織和細胞發(fā)揮抗凋亡、抑制炎癥反應(yīng)的作用[7]。新近研究顯示，RSV能夠能夠通過抑制NLRP3表達，緩解LPS誘導的人肺上皮細胞焦亡[8]。另外，RSV能夠通過調(diào)控miR-223p/NLRP3信號減少皮質(zhì)神經(jīng)元細胞炎癥性死亡，從而發(fā)揮神經(jīng)元保護作用[9]。但是，目前有關(guān)RSV對NEC細胞焦亡的影響及其作用機制尚不明確。因此，本研究擬通過構(gòu)建NEC新生小鼠模型，探究RSV對NEC細胞焦亡的影響及其可能的作用機制，進而為臨床治療提供新的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物 選取SPF級，5日齡C57BL/6新生小鼠，體質(zhì)量為(4.35±0.25)g , 湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證：SCXK(湘)2018-0001。

1.1.2試劑與儀器 白藜蘆醇(深圳匯鑫榮生物有限公司，純度≥99%，批號：090226)；配方奶粉(Abbott Laboratories，美國)；LPS(Sigma公司，美國)；多聚甲醛(碧云天生物技術(shù)有限公司，上海)；蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司，上海)；caspase-1抗體(武漢三鷹，批號：22915-1-AP)；GSDMD抗體(武漢三鷹，批號20770-1-AP)；IL-1β抗體(Cell Signaling Technology公司，批號：12507)；IL-18抗體(Cell Signaling Technology公司，批號：54943)；β-actin(碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：AF5001)；山羊抗小鼠IgG二抗(碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：A0412)；山羊抗兔IgG二抗(碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：A0408)；Western blot一抗、二抗稀釋液(碧云天生物技術(shù)有限公司)；ECL化學發(fā)光試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：P0018FS)；蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：C0105S)；小鼠IL-1β ELISA檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：PI301)；小鼠IL-18 ELISA檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：PI553)；實時熒光定量PCR測定試劑盒(TAKARA，美國)。單功能酶標儀(湖南湘儀技術(shù)有限公司)；低溫、高速離心機(湖南湘儀實驗室儀器有限公司)；細胞組織碾磨儀(武漢賽維爾生物技術(shù)有限公司)；Western blot檢測裝置(美國Bio-Rad伯樂公司)；熒光倒置顯微鏡(日本/奧林巴斯Olympus)；ChemiDoc XRS+成像系統(tǒng)(美國 Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1動物分組與給藥干預(yù) 將5日齡的新生C57BL/6小鼠30只，隨機分為對照組(Control)、壞死性小腸結(jié)腸炎模型組(NEC)以及RSV藥物干預(yù)組(RSV)，每組小鼠各10只。NEC組小鼠：置于保溫箱內(nèi)，人工喂養(yǎng)，按照參考文獻[10]方法進行配方奶粉喂養(yǎng)，每天4次，每次50 μL·g-1，并將小鼠置于100%氮氣缺氧箱中，缺氧30 s，隨后置于4 ℃冰箱中，冷刺激10 min，每日10 ∶00、14 ∶00、22 ∶00分別行1次缺氧冷刺激，連續(xù)3 d；在小鼠出生后6 d和7 d分別給予3 mg·kg-1的的LPS灌胃，雙盲法行腸組織病理評分分值≥2分，認為成功構(gòu)建NEC小鼠模型。RSV藥物干預(yù)組小鼠于6-11 d，每日1次，每次給予RSV(將RSV溶解于0.5%羧甲基纖維素鈉中濃度為0.1 mg·g-1)灌胃處理，于12 d處死小鼠，期間小鼠記錄造模前后的體質(zhì)量，解剖留取小鼠小腸末端回腸組織進行后續(xù)研究。

1.2.2各組新生小鼠一般情況觀察 觀察各組新生小鼠的活動以及胃腸反應(yīng)狀況并記錄小鼠體質(zhì)量。

1.2.3各組小鼠腸組織病理形態(tài)學觀察 各組小鼠于處理d 12時處死，取回腸組織，肉眼觀察小鼠腸組織腸腔內(nèi)積氣，出血情況、壞死以及形態(tài)串珠樣改變等。取小鼠回腸組織1-2 cm，采用4%的多聚甲醛溶液進行固定，再用不同濃度的乙醇溶液梯度脫水，然后用二甲苯進行組織透明，最后經(jīng)石蠟包埋，切片，染色。步驟根據(jù)試劑盒操作說明進行HE染色操作，光學顯微鏡下觀察小鼠回腸組織形態(tài)和結(jié)構(gòu)。

1.2.4腸組織IL-1β、IL-18含量測定 收集各組小鼠腸組織，按照組織質(zhì)量 ∶裂解液體積比=1 ∶5，裂解組織，4 ℃、12 000×g離心15 min并收集各組上清液按照江蘇碧云天公司提供的IL-1β和IL-18試劑盒進行各自濃度測定。

1.2.5Western blot檢測腸組織caspase-1、GSDMD、IL-1β和IL-18表達 取各組大鼠腸組織，PBS潤洗1-2次，離心，按照腸組織碾磨體積 ∶加入細胞組織裂解液體積=1 ∶5，冰上裂解1 h；4 ℃、12 000×g離心15 min，收集上清液，采用BCA法進行蛋白質(zhì)濃度定量檢測；然后取各組大鼠腸組織總蛋白30 μg，上樣至聚丙烯酰胺80 V凝膠電泳，80 V電泳30 min后，轉(zhuǎn)120 V、電泳60 min，至溴酚藍指示電泳至凝膠最底層。依據(jù)蛋白質(zhì)指示marker和目的蛋白分子量大小進行，切取目的膠條，采用濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜法將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜時長2 h。用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，孵育caspase-1抗體(1 ∶1 000)，GSDMD抗體(1 ∶1 000)，IL-1β抗體(1 ∶500)、IL-18抗體(1 ∶500)以及β-actin抗體(1 ∶2 000)，4 ℃過夜，孵育對應(yīng)的山羊抗小鼠二抗或者山羊抗兔二抗((1 ∶5 000)1-2 h，；搖床搖晃上加TPBS洗滌3次，5 min/次，然后加入顯影液，顯影并拍照。

1.2.6實時熒光定量PCR檢測腸組織miR-223表達 依據(jù)RNA提取試劑盒說明書步驟提取小鼠腸組織總RNA，并運用紫外分光光度計檢測總RNA的濃度與純度。以RNA為模板，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟將其逆轉(zhuǎn)錄為單鏈cDNA。再以cDNA為模板，根據(jù)廣州銳博公司設(shè)計合成的PCR引物進行擴增。擴增條件：92 ℃，30 s；92 ℃，5 s；60 ℃，31 s，共進行30個循環(huán)。采用7300 System SDS Software 分析數(shù)據(jù)，根據(jù)2-△△Ct值相對定量樣本中目的基因表達水平。其中miR-223：F:5′-GGGTGTAAAACGCAGCTCA-3′，R:5′-CGGTCGTGTCAGTTTGTCAA-3′；U6：F:5′-CCTCACTGTCCACCTTCCA-3′，R:5′-GGGTGTAAAACGCAGCTCA-3′。

2 結(jié)果

2.1 各組新生小鼠一般情況比較Control組新生小鼠生長發(fā)育正常，未出現(xiàn)胃腸道癥狀，體質(zhì)量逐漸增加。NEC組新生小鼠于造模后3 d出現(xiàn)腹脹、腹瀉、稀便等癥狀，發(fā)育遲緩，體質(zhì)量降低(P<0.01)。RSV干預(yù)組新生小鼠體質(zhì)量增加(P<0.05)(Tab 1)，腹脹、腹瀉、稀便等癥狀減輕。

Tab 1 Changes in body mass of each group of newborn mice before and after modeling n=6)

2.2 各組新生小鼠腸道組織大體及病理變化大體觀察顯示，Control組小鼠腸組織呈現(xiàn)淡黃色、部分出血樣改變、腸道無脹氣。NEC組小鼠可見腸道明顯損傷，腸道脹氣明顯，腸壁變薄，易破損，呈現(xiàn)串珠樣改變。RSV干預(yù)組小鼠腸組織大部分呈現(xiàn)淡黃色，彈性尚可，腸道有輕度脹氣，有輕度串珠樣變化。病理組織切片顯示，Control組小鼠腸組織結(jié)構(gòu)清晰正常，腸道絨毛高聳以及上皮完整，黏膜層、黏膜下層和固有層無斷裂，充血水腫現(xiàn)象；NEC組小鼠腸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)紊亂，壞死嚴重，絨毛變性明顯部分脫落并伴有水腫，肌層變薄，斷裂等；RSV組小鼠腸組織損傷明顯減輕，形態(tài)結(jié)構(gòu)排列相對規(guī)則，絨毛層次不齊，水腫現(xiàn)象減輕，黏膜層、黏膜下層和固有層未見明顯分離(Fig 1)。

Fig 1 Observation of gross and pathological morphology of intestinal tissues of newborn mice in each group (×200)

2.3 RSV對NEC小鼠細胞焦亡的影響與Control組相比，NEC組小鼠腸組織cleaved-caspase-1、GSDMD-N、IL-1β和IL-18蛋白表達上調(diào)(P<0.01)，caspase-1和GSDMD-N表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與NEC組相比，RSV干預(yù)組小鼠腸組織cleaved-caspase-1、GSDMD-N、IL-1β和IL-18蛋白表達下調(diào)(P<0.05或P<0.01)，caspase-1和GSDMD-N表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(Fig 2)。ELISA檢測與Control組相比，NEC組小鼠腸組織IL-1β和IL-18含量增加(P<0.01)；與NEC組小鼠相比，RSV組小鼠腸組織IL-1β和IL-18含量降低(P<0.05)(Fig 3)。

2.4 RSV對NEC小鼠miR-223表達的影響與Control組相比，NEC組小鼠腸組織miR-223表達下調(diào)(P<0.01)；與NEC組相比，RSV組小鼠腸組織miR-223表達上調(diào)(P<0.01)(Fig 4)。

Fig 2 Effect of RSV on pyroptosis of intestinal tissue cells in newborn mice n=6)

Fig 3 Effect of RSV on content of IL-1β and IL-18 in intestinal tissues of newborn mice n=6)

Fig 4 Effect of RSV on expression of miR-223 in intestinal tissues of newborn mice n=6)

3 討論

NEC是由多種因素導致的腸道屏障弱化，炎癥反應(yīng)加劇，上皮損傷并形成惡性循環(huán)的一種嚴重危害早產(chǎn)兒生命健康的獲得性胃腸疾病，但是其發(fā)病原因尚不清楚。目前，廣泛性研究認為缺血缺氧、感染、腸道菌群的失衡等是誘發(fā)NEC的重要因素。新近研究表明，炎癥反應(yīng)的失衡亦是導致NEC腸道損傷的重要原因，過度的炎癥因子釋放導致組織和細胞的炎癥級聯(lián)反應(yīng)進而誘導細胞死亡，加重NEC的進程[11]。IL-1β能夠通過募集、激活免疫細胞，誘發(fā)炎癥介質(zhì)釋放并介導炎癥級聯(lián)放大反應(yīng)，最終誘導NEC腸道損傷[12]。另外，TNF-α亦可以通過誘導小鼠小腸上皮細胞凋亡和炎癥性死亡誘導小鼠腸黏膜損傷[13]。以上研究表明，炎癥在NEC疾病進展中發(fā)揮重要作用。因此，明確NEC炎癥的發(fā)生機制對改善和治療NEC尤為關(guān)鍵。細胞焦亡作為一種新的炎癥性細胞死亡方式，在心血管、腫瘤、呼吸以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病均得到深入研究。組織和細胞產(chǎn)生適度焦亡反應(yīng)可以維持機體的穩(wěn)態(tài)，一旦細胞焦亡失衡會誘導炎癥級聯(lián)放大反應(yīng)，加重組織和細胞損傷。對此，本研究首先通過構(gòu)建NEC新生小鼠模型，探究細胞焦亡與NEC的關(guān)系。結(jié)果顯示，與Control組相比，NEC組小鼠大體觀察可見腸道明顯損傷，腸道脹氣明顯，腸壁變薄，易破損，呈現(xiàn)串珠樣改變；病理組織切片顯示，腸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)紊亂，壞死嚴重，絨毛變性明顯部分脫落并伴有水腫，肌層變薄，斷裂等，表明NEC小鼠模型建立成功。進一步通過Western blot和ELISA實驗發(fā)現(xiàn)，與Control組相比，NEC組小鼠腸組織cleaved-caspase-1、GSDMD-N、IL-1β和IL-18蛋白表達上調(diào)，IL-1β和IL-18含量增加。以上實驗結(jié)果初步表明細胞焦亡參與了NEC小鼠腸道損傷。RSV具有典型抗炎活性作用，其能夠通過抑制炎癥因子釋放，緩解多種細胞焦亡。與NEC組相比，RSV組小鼠腸組織cleaved-caspase-1、GSDMD-N、IL-1β和IL-18蛋白表達下調(diào)，IL-1β和IL-18含量降低，說明RSV能夠通過抑制細胞焦亡，緩解NEC小鼠腸道損傷。那么有關(guān)RSV對NEC小鼠細胞焦亡的調(diào)控機制又是如何呢？

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長約20-24 nt的內(nèi)源性非編碼小RNA，它可通過與靶基因3′非翻譯區(qū)(3′-UTR)結(jié)合，降解靶基因mRNA或抑制其翻譯，從而降低靶基因的表達水平，參與調(diào)控多種基因表達。既往研究證實miRNA與NEC密切相關(guān)。miR-223位于X染色體q12位點，表達受到多個轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控[14]。在一項隊列研究中證實43例NEC患者糞便中miR-223表達顯著高于非NEC患者[15]。另外，在對NEC患兒外周血白細胞進行高通量測序顯示，與對照組相比，NEC組共有482個差異表達miRNA，其中已知58個上調(diào)，68個下調(diào)，has-miR-223-5p表達與測序結(jié)果一致上調(diào)[16]。上述研究提示：miR-223可能是NEC的一種重要調(diào)控miRNA。研究發(fā)現(xiàn)miR-223-3p參與包括免疫系統(tǒng)-炎癥反應(yīng)、血管系統(tǒng)疾病、血液系統(tǒng)疾病等。但是有關(guān)miR-223在NEC中的作用機制尚不清楚。本研究通過RT-PCR檢測各組新生小鼠腸組織miR-223表達水平，結(jié)果顯示與Control組相比，NEC組小鼠腸組織miR-223表達下調(diào)；與NEC組小鼠相比，RSV組小鼠腸組織miR-223表達上調(diào)。本研究結(jié)果miR-223表達水平與以往研究不同可能是因為檢測標本的差異。既往文獻資料顯示，在LPS誘導的人腎小管上皮細胞焦亡中，miR-223表達下調(diào)，過表達miR-223能夠靶向NLRP3抑制LPS誘導的人腎小管上皮細胞焦亡[17]。另外，在大鼠細菌性腦膜炎模型中，RSV能夠上調(diào)miR-223，抑制NLRP3，進而降低皮至神經(jīng)元細胞炎性死亡[9]。本研究結(jié)果表明，RSV能夠抑制NEC小鼠細胞焦亡，緩解小鼠腸道損傷，其可能與上調(diào)miR-223表達相關(guān)。

綜上所述，RSV抑制NEC小鼠腸組織細胞焦亡，緩解NEC腸道損傷，其機制可能與上調(diào)miR-223表達相關(guān)。以上研究結(jié)果初步闡明了RSV在NEC中的作用，進一步豐富了NEC小鼠細胞焦亡的發(fā)生機制，以其為NEC治療提供新的思路。但是有關(guān)miR-223是如何調(diào)控細胞焦亡尚不清楚。因此，在后續(xù)的研究中計劃將通過體外培養(yǎng)小鼠小腸上皮細胞，探究過表達miR-223對LPS誘導小腸上皮細胞焦亡的影響，進而為RSV治療NEC提供可靠的實驗依據(jù)。