賈元威，王 萍，謝海棠，沈 杰，胡容峰

(1.皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院藥物臨床評(píng)價(jià)中心，安徽 蕪湖 241001； 2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230012)

偏頭痛流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)顯示，偏頭痛的流行病學(xué)、臨床特征和病理生理學(xué)存在顯著性別差異，男女比例約為1 ∶2-1 ∶3，對(duì)女性群體的危害更大[1-5]。血清代謝組學(xué)靈敏度高，檢測(cè)樣本易于獲取，常作為疾病早期小分子代謝物變化的重要檢測(cè)手段[6]。本研究構(gòu)建硝酸甘油型實(shí)驗(yàn)性偏頭痛大鼠模型，基于SCIEX TripleTOF? 5600 LC-Q/TOF-MS分析技術(shù)，采用血清代謝組學(xué)，探索偏頭痛性別差異機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)Sprague Dawley大鼠，體質(zhì)量(180-220) g，購(gòu)買自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(魯)20190003。

1.1.2 試劑與儀器 硝酸甘油注射液(河南潤(rùn)弘制藥股份有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字 H20057216)；SCIEX TripleTOF? 5600 LC-Q/TOF-MS(Foster City, CA)。

1.2 方法

1.2.1 硝酸甘油型實(shí)驗(yàn)性偏頭痛大鼠模型構(gòu)建 空白組與模型組，20只大鼠，各包括雌雄兩組。大鼠隔天連續(xù)(d 1、3、5、7、)皮下注射硝酸甘油(10 mg·kg-1, 2 mL·kg-1)。

1.2.2 樣本采集 3%戊巴比妥鈉(40 mg·kg-1)進(jìn)行麻醉，使用采血針腹主動(dòng)脈采血至5 mL采血管(無(wú)抗凝劑)，4 ℃靜置過(guò)夜，8 000 r·min-1離心15 min，取血清分裝于干凈的EP管中，-80 ℃保存待測(cè)。

1.2.3 樣本預(yù)處理 血清50 μL加入200 μL含有內(nèi)標(biāo) 13C-谷氨酰胺的甲醇溶液(10 mg·L-1)，渦旋震蕩5 min，4 ℃，18 000 r·min-1、離心10 min。取上清200 μL于EP管中, 減壓揮干溶劑(3.5 h，不加熱，真空度10，Temp 4 ℃)，超純水100 μL復(fù)溶，4 ℃，18 000 r·min-1，離心10 min，取上清20 μL進(jìn)樣。

1.2.4 LC-Q/TOF-MS分析條件 色譜柱：Amide XBridge HPLC (3.5 μm; 4.6 mm×100 mm; Waters, USA)，流動(dòng)相為5 mmol·L-1醋酸銨(pH 9)和5%乙腈，柱溫40 ℃，流速0.4 L·L-1，梯度洗脫。MS檢測(cè)采用正離子和負(fù)離子兩種模式進(jìn)行，ESI源參數(shù)：Gas 1，33psi；Gas 2，33psi；CUR，25 psi；離子噴霧電壓-4 500/4 500 V；TEM，500 ℃；CE：-10/10 V。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用 Analyst TF 1.6.1(AB SCIEX，MA，USA)進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集，使用 AB SCIEX 的PeakView 和 MultiQuant 2.0進(jìn)行數(shù)據(jù)探索和峰面積積分。校正后的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P 13.0(Umetrics，Sweden)軟件中進(jìn)行PLS-DA多元變量統(tǒng)計(jì)分析；Metabo Analyst 4.0 (http://www.metaboanalyst.ca)檢索平臺(tái)進(jìn)行代謝通路分析。

2 結(jié)果

2.1 模型構(gòu)建與驗(yàn)證與空白組相比，雌雄大鼠模型組行為學(xué)變化(0-120 min撓頭次數(shù))明顯升高、血清中降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)含量明顯升高、血清中五羥色胺(5-HT)含量模型組表明明顯降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。模型建立成功。

2.2 多元統(tǒng)計(jì)分析雄性大鼠和雌性大鼠血清樣本 PLS-DA 模型R2Y、Q2分別為 0.839、0.62與0.944、0.651，表明空白組雄性大鼠和雌性大鼠血清樣本與模型組雄性大鼠和雌性大鼠血清樣本能完全分離開，顯示兩組大鼠血清具有明顯的代謝水平差異。

Tab 1 Serum metabolism biomarkers in migraine model and healthy control group

2.3 大鼠偏頭痛差異代謝物篩選與鑒定通過(guò)SPSS 18.0軟件對(duì)空白組大鼠和模型組大鼠進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)初步篩選出差異代謝物，通過(guò)Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異代謝物進(jìn)行鑒定。最終篩選出與偏頭痛有關(guān)的差異代謝物雄性大鼠23個(gè)，雌性大鼠9個(gè)(Tab 1)。

3 討論

應(yīng)用Metabo Analyst 4.0在線工具對(duì)雌雄大鼠體內(nèi)差異代謝物進(jìn)行富集拓?fù)浞治?，雄性大鼠主要涉及代謝通路為：氨?；?tRNA生物合成、嘧啶代謝、精氨酸生物合成、乙醛酸和二羧酸代謝、磷酸戊糖途徑、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、谷胱甘肽代謝、酮體的合成與降解。雌性大鼠主要涉及代謝通路：氨?；?tRNA生物合成、乙醛酸和二羧酸代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成。本研究為偏頭痛性別差異血清代謝組學(xué)的首次報(bào)道。