郎曉娜，邱玉玲，孔德新

(1.天津醫(yī)科大學藥學院，天津 300070；2.天津市天津醫(yī)院藥學部，天津 300211)

雙黃杞貞克瘤方包含的黃精、靈芝、黃芪、枸杞子和女貞子5種中藥，均具有顯著地抗腫瘤功效。本研究對該組方進行網(wǎng)絡藥理學分析，研究組方的活性成分和抗腫瘤機制，為今后的實驗研究提供有效且合理的數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 收集和篩選雙黃杞貞克瘤方中的5種中藥(黃芪、黃精、枸杞子、女貞子、靈芝)的活性成分在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫TCMSP(https://tcmspw.com/tcmsp.php)中搜索并收集黃芪、黃精、枸杞子、女貞子和靈芝的活性成分及靶點。本文篩選藥物活性成分的依據(jù)是口服利用度(OB)≥0.3，類藥性(DL)≥0.18，從而進行篩選。并且找到其相對應的靶點。將其導入Excel表格中進行規(guī)范化處理以便于后續(xù)研究分析。整理后的靶點使用Uniprot 數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org)，將靶點的來源物種校正為Human，并整理記錄靶點蛋白的基因信息，用于之后研究的規(guī)范性處理。

1.2 收集疾病的相關靶點信息通過Gene Cards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)、TTD數(shù)據(jù)庫(http://db.idrblab.net/ttd/)和OMIM數(shù)據(jù)庫(https://www.omim.org/)以“tumour”為關鍵詞檢索腫瘤相關靶點，并將其導入Excel表格中進行規(guī)范化處理以便于后續(xù)研究分析。

1.3 篩選核心靶點并構(gòu)建網(wǎng)絡圖將活性成分所對應的靶點基因和腫瘤相關靶點基因進行匹配，通過繪制韋恩圖找到核心靶點(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)。采用Cytoscape 3.7.2軟件來構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點”和“核心活性成分-核心靶點”網(wǎng)絡。

“藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡中的節(jié)點表示這5種中藥的活性成分以及活性成分對應的靶點基因。整體網(wǎng)絡是來展示藥物-活性成分與其對應靶點的聯(lián)系。為作圖易看并且方便，成分用不同顏色區(qū)分，各個活性成分用其名稱的拼音首字母加阿拉伯數(shù)字標記，5種中藥共有的成分用大寫字母A、B、C表示?！昂诵幕钚猿煞?核心靶點”網(wǎng)絡中的節(jié)點表示與疾病相關的活性成分及其對應靶點基因。通過構(gòu)建網(wǎng)絡來探討5種中藥抗腫瘤的作用機制。

1.4 構(gòu)建蛋白質(zhì)網(wǎng)絡PPIString數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/，Version11.0)可以用來檢索蛋白質(zhì)之間的相互作用關系。將“1.3”項中所獲得的核心靶點導入String數(shù)據(jù)庫，將研究物種設置為人類(Homo sapiens)，將置信度選擇“高置信度”(置信度>0.9),其他參數(shù)為默認值，同時刪除網(wǎng)絡中未與其他基因靶點具有互作關系的基因靶點，從而獲得結(jié)果可信度較高的重要基因靶點蛋白的互作關系。將網(wǎng)絡數(shù)據(jù)導入 Cytoscape3.7.2軟件進行可視化處理，繪制蛋白互作網(wǎng)絡圖。設置用網(wǎng)絡中的節(jié)點的大小以及顏色深淺來反映Degree值的大小，邊的粗細來反映Combine score的大小。

1.5 對靶點進行GO分析，KEGG通路富集在 Metascape在線平臺(http://metascape.org/)輸入核心靶點，設置P<0.01，進行 GO富集分析[由細胞成分(cellular component，CC)、分子功能(molecular function，MF)、生物過程(biological process，BP)三部分組成]和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)分析，按P值升序排列，各選擇前20條分析結(jié)果，通過OmicShare網(wǎng)站(https://www.omicshare.com/)分別繪制高級氣泡圖，將結(jié)果可視化。

小波變換的閾值去噪過程中,選取合適的閾值和恰當?shù)姆纸鈱哟问潜ＷC良好去噪效果的首要條件。為避免因閾值選取不合理而影響信號去噪,本文在對微流控芯片信號去噪過程中引進能量元的方法,通過能量元放大有用信號和噪聲小波系數(shù)之間的差異,在閾值選取時有更大的裕度[11],更容易選取較為合理的閾值。

1.6 繪制“靶點-通路”網(wǎng)絡圖將得到的前20條KEGG富集通路與相關作用靶點整理后導入Cytoscape3.7.2中，繪制“靶點-通路”網(wǎng)絡圖。

2 結(jié)果

2.1 活性成分篩選結(jié)果通過TCMSP數(shù)據(jù)庫共檢索到黃芪的化學成分87個，黃精的化學成分38個，枸杞子的化學成分188個，靈芝的化學成分242個，女貞子的化學成分119個。以OB值≥0.3，DL值≥0.18為標準篩選得到各高度活性的化合物，得到黃芪的活性成分20個，黃精的活性成分12個，枸杞子的活性成分45個，靈芝的活性成分61個，女貞子的活性成分13個。合并整理后得到共145個活性成分，其中有3個活性成分重疊出現(xiàn)，結(jié)果見Tab 1。由于數(shù)量較多，表格只展示部分活性成分。

在TCMSP數(shù)據(jù)庫繼續(xù)用活性成分去檢索其相關靶點，將沒有搜索結(jié)果的活性成分刪除，把5種中藥找到的活性成分及對應靶點整理到Excel表格中，將每種中藥的相關靶點合并去重，并用Uniprot數(shù)據(jù)庫為靶點基因找出對應的基因名，將靶點的來源物種校正為 Human，找不到的靶點視為無效并刪除，將結(jié)果規(guī)范化，用于以后的分析。得到的結(jié)果分別是：黃芪的靶點為200個，黃精的靶點為76個，枸杞子的靶點190個，靈芝的靶點為37個，女貞子的靶點為174個。繪制韋恩圖后可發(fā)現(xiàn)5種中藥的靶點都有交集，共同擁有的靶點有22個。體現(xiàn)出這5種中藥之間共同靶點的關系，揭示其協(xié)同作用的藥理學特點。5種中藥的靶點合并去重后，通過Uniprot數(shù)據(jù)庫規(guī)范化以后共得到241個靶點。通過Cytoscape3.7.2軟件作“藥物-活性成分-靶點”的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡圖。

通過作圖得出：網(wǎng)絡中共319個節(jié)點，1 215條邊。319個節(jié)點包括78個活性成分和241個靶點。其中每個活性成分平均作用于15.58個靶點，每個靶點鏈接藥物數(shù)量為5.04。這代表5種中藥是有共同的成分和靶點作用于疾病。藥物作用是多途徑、多靶點、多環(huán)節(jié)的，整體以協(xié)同方式發(fā)揮藥效。

結(jié)果顯示，擁有最多靶點的是槲皮素(quercetin)，共有146個；其次是山奈酚(kaempferol)，共有60個；木犀草素(luteolin)，共有55個；7-O-甲基-異微凸劍葉莎醇(7-O-Methylisomucronulatol)共42個；β-谷甾醇(β-sitosterol)，共35個靶點。此外，槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇這3種化合物重復出現(xiàn)在5種中藥中，表明該成分有關鍵的作用。

2.2 疾病基因篩選結(jié)果通過OMIM平臺，TTD數(shù)據(jù)庫，Gene Cards數(shù)據(jù)庫對疾病靶點進行搜索，以“tumour”為關鍵詞檢索腫瘤的疾病相關靶點。OMIM平臺搜索到相關基因354個，TTD數(shù)據(jù)庫搜索到87個，Gene Cards數(shù)據(jù)庫由于數(shù)量過多，按照Relevance Score分數(shù)由高到低進行排序，篩選到數(shù)值較大的靶點，共搜索到930個，合并三大數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)之后去重共得到1 285個疾病靶點。

Tab 1 The active compounds in five kinds of traditional Chinese medicine with their OB and DL parameters

2.3 核心靶點篩選及構(gòu)建網(wǎng)絡圖將藥物靶點和與腫瘤相關的靶點基因進行匹配，并繪制韋恩圖得到核心靶點，見Fig 1。

Fig 1 Matching of target genes between disease and drug

其次，可得知共有113個靶點是5種中藥共同直接作用于腫瘤的核心靶點。再將靶點數(shù)據(jù)及其相關活性成分導入Cytoscape軟件可構(gòu)建“核心活性成分-核心靶點”的網(wǎng)絡圖，可發(fā)現(xiàn)核心活性成分和核心靶點之間是緊密相連，這些與關鍵靶點有相互作用關系的藥物成分可能是藥物活性成分發(fā)揮抗癌作用的重要物質(zhì)基礎。

通過網(wǎng)絡分析并獲得度值(Degree)排名前10的核心靶點，其中RB1和CCND1度值相同，均被選入。見Tab 2。

Tab 2 Key targets

2.4 構(gòu)建蛋白質(zhì)網(wǎng)絡PPI通過將這113個核心靶點導入String數(shù)據(jù)庫得到蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡數(shù)據(jù)，用Cytoscape3.7.2軟件得到這些靶點的關系網(wǎng)，見Fig 2。設置網(wǎng)絡中的節(jié)點大小以及顏色深淺反映了Degree值大小，顏色較深、圓圈較大的基因是度值較高的靶點基因，連線較粗、顏色較深表示靶點之間相關性較大。根據(jù)度值排名靠前的靶點作為核心靶點，用Cytoscape3.7.2軟件得到更清晰簡易的關系網(wǎng)，見Fig 3。

Fig 2 Protein interaction network of key targets

Fig 3 Protein interaction network of top key targets

2.5 對靶點進行GO分析，KEGG通路富集通過使用Metascape在線平臺(http://metascape.org/)輸入核心靶點，設置P<0.01，進行GO富集分析和KEGG分析，按P值升序排列后，再通過OmicShare平臺對結(jié)果進行可視化分析。

2.5.1GO富集分析 在Metascape數(shù)據(jù)庫以P<0.01對結(jié)果進行篩選，對113個核心靶點進行GO功能富集分析。將P值按照升序排列后可以發(fā)現(xiàn)：藥物抗腫瘤的作用靶點是涉及大量不同的生物學過程，共有2 236個GO術(shù)語條目，其中CC為66個，MF為132個，BP為2 038個，以校正后P為標準升序選取BP前20條作圖，圖左側(cè)為富集名稱，氣泡顏色由紅到藍代表 neg.Log10(P)值由小到大，氣泡越大代表該通路的基因計數(shù)越多，橫軸代表輸入基因占該通路基因的比率，導入OmicShare平臺處理，見Fig 4-6。

Fig 4 GO-biological process analysis of key targets

Fig 5 GO-cellular component analysis of key targets

2.5.2KEGG分析 這5味中藥對作用于腫瘤的PPI網(wǎng)絡中的核心靶點主要涉及影響腫瘤細胞增殖和凋亡的信號通路如MAPK信號通路、PI3K/Akt信號通路以及TNF信號通路等,前列腺癌和膀胱癌發(fā)生和發(fā)展相關的通路，糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、肺結(jié)核信號通路和病毒感染的信號通路等方面。根據(jù)氣泡圖可得知這5味中藥對于腫瘤的干預，涉及了多個生物過程，見Fig 7。

2.6 繪制“靶點-通路”網(wǎng)絡圖將雙黃杞貞克瘤方中前20條KEGG富集通路和其對應的核心靶點導入Cytoscape3.7.2，繪制出“靶點-通路”網(wǎng)絡圖，網(wǎng)絡圖可反映出該組方抗腫瘤具有“多靶點、多通路”的調(diào)控特點。

Fig 6 GO-molecular function analysis of key targets

Fig 7 KEGG pathway analysis of key targets

3 討論

本研究分析了雙黃杞貞克瘤方的5種成分：黃精、靈芝、黃芪、枸杞子和女貞子，從中得到的145個有效活性成分，通過網(wǎng)絡圖分析預測出5個潛在的活性成分：槲皮素、山奈酚、木犀草素、7-O-甲基-異微凸劍葉莎醇、β-谷甾醇。槲皮素是廣泛的存在于多種藥物中的多醇羥基黃酮類化合物，有研究表明它能通過誘導凋亡、抑制遷移來抑制宮頸癌細胞的生長[5]。山奈酚是一種黃酮類化合物，報道顯示其可以抑制多種腫瘤細胞周期進程，誘導細胞凋亡，從而抑制腫瘤的遷徙和轉(zhuǎn)移[6-8]。β-谷甾醇可以有效的抑制結(jié)腸癌、前列腺癌和乳腺癌等癌癥細胞的增殖和遷移[9]。這幾種潛在的活性成分在雙黃杞貞克瘤方抗腫瘤活性中發(fā)揮重要作用。

通過蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡圖分析并預測，本研究獲得的與通路密切相關的核心靶點是TP53、AKT1、JUN、MAPK1、TNF、RELA、IL-6、MAPK8、MAPK14、RB1、CCND1，該結(jié)果與之前預測的靶點基本相同。TNF又稱腫瘤壞死因子，參與腫瘤細胞的凋亡過程、影響腫瘤血管系統(tǒng)和增強宿主的免疫力等。AKT1為一種蛋白激酶，參與了乳腺癌、前列腺癌等多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復發(fā)的多個環(huán)節(jié)[10]。AKT1可以作為肺癌的早期診斷標志物，成為抗肺癌新藥研發(fā)的靶點之一[11]。TP53是重要的抗癌基因之一，通過在細胞核中的轉(zhuǎn)錄依賴功能調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，參與細胞周期進程。TP53還可以通過非轉(zhuǎn)錄依賴功能誘導細胞凋亡和自吞噬[12]。TP53可作為很多腫瘤的檢測指標，比如：淋巴瘤、胃癌、血液病和結(jié)腸癌、乳腺癌、食管癌、卵巢癌、肺癌等[13]。c-Jun是JUN基因中的一種，研究證明，c-Jun可以作為乳腺癌的預后指標，也參與結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展[14]。MAPK1、MAPK8和MAPK14均為絲裂原活化蛋白激酶，在多種腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達，如胃癌、肝癌和胰腺癌等[15]。原癌基因CCND1(細胞周期蛋白D1)的表達異常在乳腺癌、胃癌和膀胱癌等腫瘤細胞的遷移和侵襲過程中有著重要作用[16]。RB1(視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白1)對視網(wǎng)膜母細胞瘤、胰腺癌、乳腺癌和肺癌等都有抑制作用。IL-6是由多種細胞產(chǎn)生的多功能細胞因子，在T淋巴細胞、B淋巴細胞和造血干細胞的增殖，自身免疫性疾病發(fā)生、腫瘤細胞生長等方面都有重要作用[17]。RELA能激活癌細胞的增殖或遷移以促使食管癌進展。提示我們，預測出的潛在核心靶點均與抗腫瘤機制有關，都在藥物治療過程中靶向性發(fā)揮抗腫瘤作用。

結(jié)合GO生物過程分析和KEGG富集分析的結(jié)果，得到有關該組方抗腫瘤機制的信息如下：① 結(jié)果中顯示有P13K-Akt、MAPK和TNF信號通路以及Apoptosis(細胞凋亡)等。這些通路都是影響腫瘤細胞增殖和凋亡的信號通路。腫瘤是由于基因變異導致的，由于基因轉(zhuǎn)錄翻譯出現(xiàn)異常、細胞的信號傳遞出現(xiàn)失誤，就可能引起細胞的增殖異常表達，增殖過度和凋亡減少都是腫瘤細胞的基本特征。② 通路的富集結(jié)果除了以上腫瘤相關信號通路、前列腺癌和膀胱癌等具體癌癥類型發(fā)生與發(fā)展相關的通路，也發(fā)現(xiàn)了糖尿病、肺結(jié)核以及病毒感染相關的信號通路，這可以解釋為這些疾病相關的某些信號通路可能與腫瘤是共通的，同時也提示我們在研究其抗腫瘤作用的同時需要留意可能產(chǎn)生的副作用。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡藥理學方法分析了雙黃杞貞克瘤方的多成分-多靶點-多途徑抗腫瘤機制。結(jié)果顯示，槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇等主要活性成分作用于TP53、AKT1、JUN、MAPK1、TNF、RELA、IL-6等靶點，通過抑制腫瘤細胞的增殖、遷移，誘導凋亡，影響腫瘤血管系統(tǒng)和增強宿主免疫力等來發(fā)揮抗腫瘤作用。