單佳鈴，朱繼孝，熊浩仲

(1. 南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，2. 江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與民族藥研究中心，江西 南昌 330004)

急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎(acute gout arthritis，AGA)是由于體內(nèi)嘌呤代謝增加，尿酸產(chǎn)生過多或排泄不良而導(dǎo)致血中尿酸水平升高，尿酸鹽結(jié)晶沉積在關(guān)節(jié)囊、關(guān)節(jié)滑膜或其他組織中而引起的炎性疾病[1]；酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)是一類由于長期性飲酒導(dǎo)致的慢性進行性肝臟疾病，疾病的初期表現(xiàn)為酒精性指肪肝，之后逐漸發(fā)展為酒精性肝炎、肝纖維化、肝硬化等，嚴(yán)重酗酒甚至?xí)鸶渭?xì)胞壞死導(dǎo)致肝功能衰竭，從而引起一系列的并發(fā)癥[2]。

短穗兔耳草(LagotisbrachystachysMaxim)，藏藥名“直打灑曾”，為玄參科植物短穗兔耳草的干燥全草，主要分布于甘肅、四川、青海和西藏等地?！毒е楸静荨返扔涊d短穗兔耳草味苦、平，能清肺胃瘀血、排膿，治療肺癰咳逆、胸滿吐膿血等癥,具有清熱去火、消炎解毒的功效[3]。目前從短穗兔耳草中分離的化合物主要包括黃酮類、環(huán)烯醚萜苷類、苯乙醇類、苯丙素苷類等[4-6]，現(xiàn)代藥理研究表明短穗兔耳草具有抗菌、抗各種類型肝損傷(四氯化碳、ANIT、酒精性肝損傷)、抗高尿酸血癥等[7-10]。

“網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)”是由英國藥理學(xué)家Hopkins提出，是在系統(tǒng)生物學(xué)和生物信息學(xué)的基礎(chǔ)上從網(wǎng)絡(luò)平衡的角度來認(rèn)識藥物與機體間的關(guān)系，這種多層次研究策略與復(fù)方中藥的整體觀原則相一致，為傳統(tǒng)中藥或復(fù)方中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機制研究提供了新的手段。中藥具有“多成分多靶點多途徑”的協(xié)同作用特點，傳統(tǒng)的藥理學(xué)很難全面系統(tǒng)地闡述其作用機制與分子基礎(chǔ)，而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一種新的研究方法已成為揭示中藥或中藥復(fù)方治療疾病的分子機制的一種新途徑，且目前備受中醫(yī)藥研究者的關(guān)注。分子對接是通過受體與藥物分子之間的相互作用來預(yù)測其結(jié)合模式和親合力的一種理論模擬方法。本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合分子對接技術(shù)對短穗兔耳草治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎和慢性酒精性肝損傷的分子機制進行研究，篩選并獲得短穗兔耳草治療兩種疾病的有效活性成分及作用靶點，為其后續(xù)研究提供參考。

1 方法

1.1 短穗兔耳草有效化學(xué)成分通過整理課題組前期分離所得化合物[4]及查閱國內(nèi)外文獻(xiàn)[5-6]得到短穗兔耳草中的化學(xué)成分55個。在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)中通過化合物名稱或CAS號搜尋得到化合物信息，設(shè)置口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和類藥性(drug likeness，DL)≥0.18篩選出符合條件的化合物作為有效化合物。

1.2 有效化學(xué)成分靶點的預(yù)測將獲得的有效化合物輸入TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)、PharmMapper Server(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)、CTD(http://ctdbase.org/)、SwissTargetPrediction(http://new.swisstargetprediction.ch/?)數(shù)據(jù)庫，獲得短穗兔耳草有效化合物可能作用的靶點。通過UniPrpt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)校正其蛋白名稱為官方名稱，并限定物種來源為人。

1.3 疾病靶點的預(yù)測以“Chronic alcoholic liver Disease” “Acute gout arthritis”作為檢索詞，通過Gene Cards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)、OMIM數(shù)據(jù)庫(https://omim.org/)、TTD數(shù)據(jù)庫(http://db.idrblab.net/ttd/)檢索得到兩種疾病的相關(guān)作用靶點。通過UniPrpt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)校正其蛋白名稱為官方名稱，并限定物種來源為人。將上述有效成分的相關(guān)靶點與疾病的相關(guān)靶點取交集，獲得短穗兔耳草治療慢性酒精性肝損傷和急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的共同作用靶點，以便進行后續(xù)分析。

1.4 有效成分-疾病-共有靶點網(wǎng)絡(luò)及共有靶蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將獲得的有效成分、疾病、共有靶點信息導(dǎo)入Cytoscape3.7.2繪制有效成分-疾病-共有靶點網(wǎng)絡(luò)圖。同時，為明確共有靶點間相互作用的關(guān)系，將篩選得到的共有靶點導(dǎo)入String11.0(https://string-db.org/)構(gòu)建共有靶點蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(protein proteininteraction，PPI)模型。將蛋白種類設(shè)置為人種進行操作，將最低作用閾值設(shè)置為0.400，其他參數(shù)則保留默認(rèn)設(shè)置。將PPI網(wǎng)絡(luò)模型導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件，運用“Network Analysis”功能進行分析,并依據(jù)節(jié)點度(degree)和中介中心度(betweenness centrality)評價兩種疾病的共有靶點，確定可能的關(guān)鍵靶蛋白。將獲得的關(guān)鍵靶點依次導(dǎo)入DisGeNET數(shù)據(jù)庫，獲取靶點對應(yīng)的類型。

1.5 共有靶點的GO富集分析與通路注釋分析將共有靶點導(dǎo)入DAVID Bioinformatics Resources 6.7(https://david-d.ncifcrf.gov/summary.jsp)，選擇生物過程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)和細(xì)胞學(xué)組分(cellular component，CC)進行基因本體(gene ontology，GO)分析；選擇KEGG進行靶點基因通路注釋分析，以P<0.05進行篩選，分析短穗兔耳草治療ALD和AGA的主要信號通路。

1.6 “成分-靶點”分子對接本研究選取疾病共有靶點拓?fù)浞治鲋泄?jié)點度排名前4的靶點蛋白INS、IL6、ALB、TNF作為對接蛋白與篩選所得的7個潛在活性成分的化合物分別進行對接，驗證其相互作用活性。在PBD(http://www.rcsb.org/)數(shù)據(jù)庫中下載靶點蛋白3D結(jié)構(gòu)的PDB文件，在PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫中下載化合物2D結(jié)構(gòu)的sdf格式。將準(zhǔn)備好的靶點蛋白和化合物導(dǎo)入discovery studio 2016中，利用Libdock模塊進行分子對接。結(jié)合能小于0說明受體和配體能夠自發(fā)結(jié)合，本研究參考文獻(xiàn)[11]選取結(jié)合能≤-5.0 kcal·mol-1作為其相互作用活性篩選的依據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 短穗兔耳草有效化合物的獲取根據(jù)1.1中的方法篩選得到有效化合物7個，各個化合物及其OB和DL值見Tab 1。

Tab 1 Effective compounds of Lagotisbrachystachys Maxim

2.2 作用靶點的預(yù)測結(jié)果通過PharmMapper Server、CTD、SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫預(yù)測得到的化合物相關(guān)靶點去除重復(fù)靶點后得到靶點5 027個。通過向Gene Cards、OMIM、TTD數(shù)據(jù)庫輸入“Chronic alcoholic liver Disease”關(guān)鍵詞獲得ALD疾病相關(guān)作用靶點去除重復(fù)靶點后得到靶點4 212個；通過向Gene Cards、OMIM、TTD數(shù)據(jù)庫“Acute gout arthritis”關(guān)鍵詞獲得AGA疾病相關(guān)作用靶點去除重復(fù)靶點后得到靶點662個。將所得的有效化合物相關(guān)靶點與兩種疾病的相關(guān)靶點通過VENNY2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)取交集獲得短穗兔耳草治療ALD和AGA的共同作用靶點253個。

2.3 共有靶點的網(wǎng)絡(luò)分析將獲得的有效成分、疾病、共有靶點信息導(dǎo)入Cytoscape3.7.2繪制有效成分-疾病-共有靶點網(wǎng)絡(luò)圖，其中包括2個疾病，7個活性成分，252個共有靶點。結(jié)果顯示MAPK8、MAPK14、JAK2、KDR、IGF1R、PPARG、MMP12、MMP13、MMP3、HMGCR、HCK、F2、CTSB、AKR1B1、SYK、SRC為七個活性成分的共有靶點。同時，結(jié)果表明短穗兔耳草的有效成分的靶點數(shù)均大于1，而同一靶點也會對應(yīng)多個有效成分，說明短穗兔耳草治療疾病是通過多個成分作用于多個靶點而產(chǎn)生藥效。

將獲得的253個共有靶點在string平臺中進行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)包括252個節(jié)點(其中有1個靶點未參與蛋白互作)，5 122條相互作用連線，將相互作用關(guān)系導(dǎo)入Cytoscape中，通過Network analysis工具，根據(jù)節(jié)點度和中介中心度篩選出節(jié)點度和中介中心度靠前的20個作為關(guān)鍵靶點，見Tab 2。將20個關(guān)鍵靶點導(dǎo)入DisGeNET數(shù)據(jù)庫中，獲取蛋白歸屬信息，見Tab 3。結(jié)果顯示，關(guān)鍵靶點主要涉及信號分子(signaling molecule)、激酶(kinase)、轉(zhuǎn)移酶(transferase)、轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor)。

Tab 2 Analysis of topological properties of common disease targets(top 20)

Tab 3 Protein assignment information for top 20 key targets in common targets

2.4 共有靶點的GO富集分析與通路注釋分析根據(jù)1.5的分析方法對253個共有靶點進行GO富集分析與通路分析，得到1 129個生物過程，57個細(xì)胞學(xué)組分，118個分子功能以及44條信號通路。分別取前15個條目進行可視化條形圖，見Fig 1。GO富集分析由三個部分組成，包括生物過程、分子功能和細(xì)胞組分。其中生物過程分析結(jié)果顯示，對有機物質(zhì)的反應(yīng)、細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)、對內(nèi)生刺激的反應(yīng)、對損傷的反應(yīng)、對激素刺激的反應(yīng)等生物過程在短穗兔耳草治療ALD和AGA疾病的過程中均發(fā)揮重要作用。分子功能分析結(jié)果顯示，其主要與細(xì)胞因子活性、相同蛋白質(zhì)結(jié)合、蛋白質(zhì)均二聚活性、蛋白質(zhì)酪氨酸激酶活性、蛋白質(zhì)二聚活性有關(guān)；細(xì)胞組分分析結(jié)果顯示，其主要存在于細(xì)胞外空間、細(xì)胞外區(qū)域部分、細(xì)胞外區(qū)域、細(xì)胞溶質(zhì)中。

KEGG富集分析結(jié)果顯示，Toll樣受體信號通路、NOD樣受體信號通路、JAK-STAT信號通路、FcεRI信號通路、PPAR信號通路、T細(xì)胞受體信號通路在短穗兔耳草治療ALD和AGA疾病的過程中均發(fā)揮重要作用。

2.5 分子對接驗證本研究取節(jié)點度排名前的4個靶點蛋白INS、IL-6、ALB、TNF與7個化合物進行對接，驗證其相互作用活性。其中IL-6、ALB、TNF能與7個化合物中的一個或幾個成功對接，如Tab 4所示，部分配體-蛋白相互作用(ABCD四張圖分別為2E7A與Bicuculline，3DTL與Bicuculline，2E7A與Chryseriol，6J7E與Chryseriol的對接結(jié)果)，見Fig 2。荷包牡丹堿、柯伊利素均能與蛋白ALB、TNF結(jié)合，且結(jié)合能遠(yuǎn)小于5 kcal·mol-1，表明這兩個化合物較其他成分具有良好的活性；同時，荷包牡丹堿還能與IL-6蛋白結(jié)合；而IL-6能與鄰苯二甲酸雙(2-乙基己基)酯對接成功，TNF蛋白也能與木犀草素和Arvenin I對接成功；表明短穗兔耳草能通過多成分多靶點發(fā)揮其治療疾病的作用。荷包牡丹堿通過氫鍵、碳?xì)滏I、烷基及π-烷基的疏水作用等與2E7A殘基ARG103、PRO100、CYS69等結(jié)合；通過氫鍵、烷基及π-烷基的疏水作用等與3DTL殘基ASP324、ARG209、ALA213等結(jié)合；柯伊利素通過氫鍵、碳?xì)滏I及疏水作用與2E7AY與6E7A結(jié)合。從價鍵角度來講這幾個化合物與配體都能通過多種價鍵相結(jié)合，說明其具有良好的結(jié)合穩(wěn)定性。

Tab 4 Docking results of molecules and proteins

Fig 1 GO enrichment analysis and KEGG enrichment analysis

Fig 2 Ligand-protein interaction diagram

3 討論

痛風(fēng)在藏醫(yī)的范疇又叫“直合乃”，屬于熱性疾病，認(rèn)為其是由于“血隆”失調(diào)而引發(fā)的疾病，初期表現(xiàn)皮膚紅腫熱痛而后變硬發(fā)青產(chǎn)生劇痛，后期擴散至關(guān)節(jié)筋骨，若不及時治療疾病逐漸加重致行走困難，難以治療。其可分為隆型、赤巴型、培根型和血型四種，而現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為的急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎與藏醫(yī)的赤巴型痛風(fēng)較為相似，表現(xiàn)為發(fā)熱紅腫，疼痛難忍[12]。據(jù)《四部醫(yī)典》記載肝病的發(fā)病原因可分為內(nèi)因和外因，外因多由感受濕熱疫毒之邪所致，使體內(nèi)隆、赤巴、培根、黃水和血紊亂失調(diào)[13]。酒性濕熱，飲之過量可致濕熱酒毒之邪傷肝損脾，使肝失疏泄、脾失運化，日久膠結(jié)停于脅下甚至結(jié)為痞塊形成酒癖而致慢性酒精性肝損傷的發(fā)生。同時，前期研究表明短穗兔耳草有良好的抗痛風(fēng)及抗各種肝損傷的療效[7-10]。因此這從理論和實踐上解釋了短穗兔耳草用于慢性酒精性肝損傷和痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎兩種疾病的原因，同時為我們進一步研究其分子機制提供了基礎(chǔ)。

結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接研究結(jié)果，本研究從短穗兔耳草中篩選得到7個有效化合物，分別為鄰苯二甲酸雙(2-乙基己基)酯、連翹苷、β-谷甾醇、荷包牡丹堿、柯伊利素、木犀草素、Arvenin I。分子對接結(jié)果顯示荷包牡丹堿、柯伊利素、木犀草素能與3個蛋白中的一個或幾個成功對接，提示其可能是短穗兔耳草治療兩種疾病的有效成分。其中已有研究表明木犀草素對急性酒精性肝損傷[14]和急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎[15]有一定的治療作用,連翹苷能夠通過抑制細(xì)胞凋亡在酒精性肝損傷中發(fā)揮保護作用[16]。其他化合物尚未見相關(guān)報道，有待進一步的研究。研究通過節(jié)點度和中介中心性篩選了排名靠前的20個靶點作為關(guān)鍵靶點，其中IL-6、TNF、IL-10、IL-1β、IL-4屬于炎癥細(xì)胞因子，參與各種炎癥反應(yīng)的進行，刺激趨化因子CXCL8、CCL2等的產(chǎn)生；ALB通常被用來評價機體營養(yǎng)狀況，同時也能夠反應(yīng)機體的消耗程度，如與炎癥反應(yīng)、感染性疾病、腫瘤等相關(guān)；MAPK能夠參與細(xì)胞生長、增殖、分化、癌變、轉(zhuǎn)移、凋亡等過程。已有研究表明IL-6、ALB、TNF、STAT3、CXCL8、IL-10、TLR4、IL-1β、IL-4等在治療酒精肝和痛風(fēng)或痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎中發(fā)揮重要作用。

本研究發(fā)現(xiàn)短穗兔耳草治療慢性酒精性肝損傷和痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的機制可能與調(diào)控Toll樣受體信號通路、NOD樣受體信號通路、JAK-STAT信號通路、FcεRI信號通路、PPAR信號通路、T細(xì)胞受體信號通路等通路有關(guān)，有研究已證實了短穗兔耳草能夠通過調(diào)節(jié)Toll樣受體信號通路和NOD樣受體信號通路發(fā)揮抗慢性酒精性肝損傷及痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎作用[17-18]。同時，有研究表明酒精性肝損傷和痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎皆與PPAR信號通路密切相關(guān)；JAK-STAT信號通路能夠干預(yù)調(diào)控腫瘤、呼吸系統(tǒng)疾病、血液疾病、自身免疫疾病(急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等)、肝臟疾病(非酒精性脂肪肝、病毒性肝炎、肝纖維化等)等的發(fā)生，但目前尚無與酒精性肝損傷的研究，這些研究基本與本研究的結(jié)果相似，一定程度上表明了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法的可靠性。但是關(guān)于兩種疾病與FcεRI信號通路、T細(xì)胞受體信號通路的研究尚無報道，有待于進一步驗證。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的方法初步的研究了短穗兔耳草對慢性酒精性肝損傷和急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)的調(diào)控作用。研究根據(jù)生物利用度和類藥性篩選出7個有效化合物，作用于5 027個靶點，找尋兩種疾病相關(guān)靶點4 212個，最后共得到短穗兔耳草治療兩種疾病的共有靶點253個。共有靶點經(jīng)過生物信息富集分析，得到1 129個生物過程，57個細(xì)胞學(xué)組分，118個分子功能以及44條信號通路。分子對接結(jié)果顯示荷包牡丹堿、柯伊利素、木犀草素可能為短穗兔耳草治療兩種疾病的有效化合物。該研究體現(xiàn)了短穗兔耳草多成分、多靶點、多途徑的特點，可為進一步研究短穗兔耳草的作用機制提供參考。但是，該方法由于數(shù)據(jù)庫不完全的原因存在一定的局限性，只能為我們提供初步的探索，后期的研究仍需通過實驗進行進一步的驗證。