任 星, 高 蕊，楊 靜,2, 張菀桐, 楊巧寧

(1.中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院，北京 100091；2.北京中醫(yī)藥大學研究生院，北京 100029)

抑郁癥(depression)是以心境情緒障礙為主的一種臨床癥狀，情緒低落、思維遲緩、認知功能損害、意志活動減退和軀體癥狀為其主要特征。目前因經(jīng)濟負擔、工作壓力、情感問題等導(dǎo)致的抑郁患者越來越多，隨著人們對情緒疾病所致危害的認識，許多患者開始接受藥物治療。臨床一線藥物中常用的如舍曲林、氟西汀、帕羅西汀等均屬5-羥色胺再攝取抑制劑(SSRIs)，此類藥物為臨床抗抑郁首選[1]。其他類型的第二代抗抑郁藥物也多應(yīng)用于臨床，這些藥物雖療效較為確切，但其花費高、易復(fù)發(fā)、周期長等問題給抑郁患者帶來一定的困擾。由此，越來越多的患者尋求中醫(yī)藥的治療。

抑郁癥屬中醫(yī)“郁證”范疇，歷代醫(yī)家對其病機闡述各不相同，但不外乎氣郁、陽虛、血瘀等。越來越多活血化瘀類中藥被證實具有抗抑郁的作用，其中藏紅花近年來被國內(nèi)外學者廣泛深入研究。Vahdati等[2]發(fā)現(xiàn)藏紅花能夠改善抑郁癥大鼠海馬中基因的蛋白質(zhì)表達和轉(zhuǎn)錄水平，可能通過提高神經(jīng)肽前體蛋白轉(zhuǎn)錄水平和活性磷酸化CREB從而發(fā)揮抗抑郁作用。同時，也有臨床研究證實藏紅花有關(guān)成分對于抑郁癥患者的癥狀具有良好的改善效果,Akhondzadeh等[3]進行了一個隨機、雙盲、對照臨床試驗，比較西紅花柱頭提取物與丙咪嗪的抗抑郁療效。研究結(jié)果顯示，兩個治療組均能明顯降低HAM-D評分，且組間無顯著性差異，證實藏紅花相關(guān)提取物具有抗抑郁療效。

網(wǎng)絡(luò)藥理學是計算機系統(tǒng)生物學時代到來的產(chǎn)物，是一門運用網(wǎng)絡(luò)分析技術(shù)將藥物成分、靶點、疾病間復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系與中醫(yī)藥整體性、系統(tǒng)性相結(jié)合，體現(xiàn)中藥多成分、多途徑、多靶點等特點的綜合學科[4]。本研究旨在通過網(wǎng)絡(luò)藥理學的方法探討藏紅花抗抑郁機制并進行初步分析，為藏紅花在抑郁癥的臨床應(yīng)用中提供更準確的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 獲取藏紅花藥物候選靶點登錄中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺(TCMSP Databases)，檢索并獲取藏紅花已知的化學成分，以口服生物利用度(OB)≥30%，類藥性(DL)≥0.18為條件進一步篩選藏紅花的有效化合物。將獲得的藏紅花有效化合物導(dǎo)入TCMSP 數(shù)據(jù)庫及Genecards 數(shù)據(jù)庫中獲取成分作用靶點，并排除重復(fù)靶點。運用Uniprot數(shù)據(jù)庫査詢靶點蛋白對應(yīng)的基因簡稱，得到藏紅花活性成分調(diào)控的疾病靶點。

1.2 獲取藏紅花治療抑郁癥的作用靶點登錄Genecards數(shù)據(jù)庫獲取疾病靶點，以depression為關(guān)鍵詞，人類基因為背景，提取數(shù)據(jù)庫中信度較高的相關(guān)基因靶點(score≥10)。運用Cytoscape軟件中的merge功能將藏紅花藥物成分候選靶點與抑郁癥疾病靶點取交集，獲得藏紅花治療抑郁癥的作用靶點。

1.3 藏紅花活性成分-抑郁癥靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將上述獲得的藏紅花抗抑郁作用靶點與藏紅花成分重新對接，獲得藏紅花治療抑郁癥的具體活性成分。運用Cytoscape軟件構(gòu)建藏紅花活性成分-抑郁癥靶點網(wǎng)絡(luò)(C-T network)，并用“Network Analyzer”功能進行網(wǎng)絡(luò)可視化拓撲分析。

1.4 GO生物進程及KEGG通路分析將藏紅花藥物成分治療抑郁癥的相關(guān)靶點導(dǎo)入Cytoscape軟件的ClueGO分析工具中，進行GO生物學進程及KEGG通路富集分析。

1.5 分子對接驗證選擇C-T network中獲得的degree值較高的關(guān)鍵化合物與KEGG富集分析中獲得的相關(guān)通路中的關(guān)鍵蛋白，運用Autodock vina軟件進行分子對接驗證，預(yù)測關(guān)鍵蛋白與關(guān)鍵化合物小分子的相互作用，并運用Pymol軟件將化學成分與關(guān)鍵靶點之間的對接效果進行可視化呈現(xiàn)。

2 結(jié)果

2.1 藏紅花藥物化學成分篩選利用TCMSP數(shù)據(jù)庫，以藏紅花、西紅花、番紅花為檢索詞，以O(shè)B≥30%、DL≥0.18為條件篩選得到5個化合物，并參考文獻加入2個藏紅花常用活性成分[5-6]，共得到7個藏紅花的有效活性成分，篩選結(jié)果見Tab 1。

Tab 1 List of compounds in traditional Chinese medicine saffron

2.2 藏紅花藥物候選靶點篩選將上述獲得的7個藏紅花活性成分引入TCMSP數(shù)據(jù)庫及Genecards數(shù)據(jù)庫，獲得7個活性成分對應(yīng)107個作用靶點。運用Uniprot數(shù)據(jù)庫査詢靶點蛋白對應(yīng)的基因簡稱,最終得到藏紅花調(diào)控的疾病靶點103個(4個為非人源靶點)。

2.3 藏紅花治療抑郁癥作用靶點篩選應(yīng)用Genecards數(shù)據(jù)庫，以depression為關(guān)鍵詞檢索，獲得數(shù)據(jù)庫中信度較高的相關(guān)基因靶點(score≥10)共557個。利用Cytoscape軟件中的merge功能，將上述獲得的103個藏紅花活性成分作用靶點與557個抑郁癥疾病相關(guān)靶點取交集，篩選得到25個藏紅花治療抑郁癥的關(guān)鍵靶點。

2.4 藏紅花活性成分-抑郁癥靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將上述篩選得到的藏紅花治療抑郁癥的相關(guān)靶點對接回成分，并應(yīng)用Cytoscape軟件構(gòu)建藏紅花活性成分-抑郁癥靶點網(wǎng)絡(luò)(C-T network)，見Fig 1，并用“Network Analyzer”功能對該網(wǎng)絡(luò)進行可視化拓撲分析。網(wǎng)絡(luò)包含32個節(jié)點，57條邊。其中，7個橘黃色節(jié)點代表藏紅花活性成分，形狀越大表示該成分的degree值越高；25個藍色節(jié)點代表藏紅花作用于抑郁癥的靶點(基因簡稱)并且形狀越大表示該靶點的degree值越高。在化合物方面，由圖可見degree值較高的化合物分別是quercetin槲皮素(degree=20)、kaempferol山奈酚(degree=11)、Safranal藏紅花醛(degree=7)、crocetin藏紅花酸(degree=7)、isorhamnetin異鼠李素(degree=6)。說明在藏紅花治療抑郁癥的過程中，槲皮素、山奈酚、藏紅花醛、藏紅花酸以及異鼠李素5個活性成分起主要作用。

Fig 1 C-T Network

2.5 GO生物進程及KEGG通路分析將藏紅花作用于抑郁癥的25個基因靶點導(dǎo)入Cytoscape軟件的ClueGO分析工具中進行GO生物進程及KEGG通路富集分析，得到藏紅花治療抑郁癥的生物進程及KEGG通路結(jié)果。

2.5.1生物進程聚類分析結(jié)果 通過GO生物進程分析，如Fig 2，可得知藏紅花治療抑郁癥可能主要是通過參與影響以下體內(nèi)生物進程相關(guān)：① 神經(jīng)遞質(zhì)代謝過程;② 過氧化氫的生物合成過程；③活性氧生物合成過程等。由此可知，藏紅花抗抑郁主要體現(xiàn)在調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的代謝過程和氧化應(yīng)激等方面。

2.5.2KEGG聚類分析結(jié)果 為進一步探究藏紅花治療抑郁癥的具體機制，應(yīng)用ClueGo分析工具對藏紅花抗抑郁的相關(guān)靶點進行通路分析，結(jié)果如Fig 3所示。由圖可知，藏紅花抗抑郁的相關(guān)通路包括IL-17信號通路、HIF-1信號通路及TOLL樣受體信號通路等炎癥通路以及PI3K-Akt 信號通路、MAPK信號通路、松弛素信號通路、Th17細胞分化等通路。經(jīng)進一步文獻檢索[7]，藏紅花治療抑郁癥的重要通路可能是PI3K-Akt信號通路和MAPK信號通路，本研究對這兩條通路進行分析，具體見Fig 4,5。圖中通路靶點標記為綠色，藏紅花治療抑郁癥的靶點標記為粉色。在PI3K-Akt 信號通路和MAPK信號通路中，提示藏紅花抗抑郁通過調(diào)節(jié)其中幾個環(huán)節(jié)起作用，主要靶點為BDNF、GSK3B、NOS3、TNF、IL-1、IL-6、MAPK8、JUN等。

Fig 2 GO cluster analysis results

2.6 分子對接驗證由KEGG聚類分析結(jié)果得知，在PI3K-Akt 信號通路和MAPK信號通路中，藏紅花抗抑郁主要靶點為BDNF、GSK3B、NOS3、TNF、IL-1、IL-6、MAPK8、JUN。經(jīng)進一步文獻查閱，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)是影響海馬結(jié)構(gòu)和功能改變的關(guān)鍵因子，許多藥物均通過BDNF從而發(fā)揮抗抑郁作用[8]。在配體方面，由于異鼠李素、山奈酚、槲皮素是很多中藥的化學成分，不具有代表性，因此選擇2個藏紅花中具有代表性的關(guān)鍵化合物藏紅花酸和藏紅花醛與PI3K-Akt 信號通路和MAPK信號通路中共有的靶點蛋白BDNF進行分子對接驗證。通過PDB數(shù)據(jù)庫獲得BDNF靶點的晶體結(jié)構(gòu)文件，TCMSP數(shù)據(jù)庫獲得關(guān)鍵化合物藏紅花酸和藏紅花醛的mol2格式文件。運用Autodock vina分子對接軟件上傳靶點蛋白以及藏紅花酸、藏紅花醛的結(jié)構(gòu)文件進行分子對接并用Pymol軟件將分子對接模擬驗證結(jié)果進行可視化。2種化學成分與靶蛋白均可對接成功，見Fig 6,7。故預(yù)測藏紅花中藏紅花醛和藏紅花酸在抗抑郁作用機制PI3K-Akt 信號通路和MAPK信號通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

3 討論

藏紅花具有化瘀解毒、涼血活血和解郁安神的功效。《飲膳正要》載其“主心憂郁結(jié)，氣悶不散，久服令人心喜”。近年來，相關(guān)研究表明，藏紅花在改善精神疾病包括抗抑郁，焦慮以及改善認知障礙和睡眠障礙等方面有一定進展。但很少有實驗涉及到藏紅花在抗抑郁過程中產(chǎn)生的作用機制。

本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學及分子對接手段，通過分析藏紅花與抑郁癥分子網(wǎng)絡(luò)在生物功能方面的異同，初步探索藏紅花抗抑郁的作用機制。研究發(fā)現(xiàn)在藏紅花治療抑郁癥的過程中，作用較強的化合物是槲皮素、山奈酚、藏紅花醛、藏紅花酸和異鼠李素。藏紅花醛和藏紅花酸作為藏紅花中特有的成分，近年來的相關(guān)藥理研究表明，它們都具有神經(jīng)保護作用。Tashakori-Sabzevar等[9]的研究顯示，藏紅花酸對慢性腦低灌注大鼠的大腦皮質(zhì)及海馬區(qū)域神經(jīng)元具有保護作用，并可有效防止因慢性腦灌注不足導(dǎo)致的神經(jīng)病理改變，改善大鼠空間學習記憶能力。Sadeghnia等[10]證明藏紅花醛可抑制自由基的產(chǎn)生和增加抗氧化活性，通過降低脂質(zhì)過氧化水平，對抗氧化應(yīng)激損傷保護大鼠海馬，并預(yù)防海馬硫醇氧化還原和抗氧化狀態(tài)的減弱。

Fig 3 KEGG pathway cluster analysis results

Fig 4 PI3K-Akt signaling pathway

Fig 5 MAPK signaling pathway

Fig 6 BDNF-Safranal molecular docking

Fig 7 BDNF-crocetin molecular docking

通過GO生物進程聚類分析和KEGG通路聚類分析，可得知藏紅花抗抑郁可能主要通過參與調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的代謝過程和氧化應(yīng)激等生物進程。神經(jīng)遞質(zhì)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)機制的損傷是目前廣泛研究的一類抑郁癥發(fā)病機制。5-羥色胺(5-HT)作為一種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)參與多種腦內(nèi)生理功能及病理狀態(tài)，有研究表明抑郁、焦慮癥模型大鼠腦組織中5-HT明顯低于正常大鼠[11]。抑郁癥與氧化應(yīng)激損傷關(guān)系密切[12]，是一種慢性的心理及生理應(yīng)激過程，在此過程中體內(nèi)神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的功能隨之變化，進而引起氧化應(yīng)激系統(tǒng)的激活，導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)的氧化損傷，并可能進一步誘發(fā)抑郁癥的發(fā)生發(fā)展[13]。在信號通路的調(diào)控方面，藏紅花治療抑郁癥可能主要調(diào)控IL-17信號通路、HIF-1信號通路及TOLL樣受體信號通路等炎癥通路以及PI3K-Akt 信號通路、MAPK信號通路、松弛素信號通路、Th17細胞分化等通路。本研究重點對PI3K-Akt信號通路和MAPK信號通路進行分析，發(fā)現(xiàn)藏紅花可通過BDNF、TNF、IL-1、IL-6、MAPK8、JUN、GSK3B、NOS3等靶點參與治療抑郁癥，主要體現(xiàn)在神經(jīng)營養(yǎng)因子的調(diào)節(jié)、抗炎、抗氧化應(yīng)激等方面。MAPK 信號通路存在于人體大多數(shù)細胞內(nèi)，具有廣泛的生理作用。而MAPK信號通路之一的ERK1/2通路能夠介導(dǎo)神經(jīng)營養(yǎng)因子、生長因子發(fā)揮抗抑郁作用[14]。PI3K-Akt 信號通路與抑郁癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，中樞神經(jīng)元和海馬干細胞的功能可因PI3K-Akt 信號通路受抑制而下降，相反，提高PI3K-Akt信號通路的表達，能夠有效降低海馬神經(jīng)元凋亡并促進其再生，增加海馬神經(jīng)突觸可塑性，緩解抑郁，減少精神類疾病的產(chǎn)生[15]。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族中的重要成員，是腦內(nèi)5-HT、多巴胺(DA)能神經(jīng)元的生長因子，促進5-HT、DA等神經(jīng)遞質(zhì)的合成[16]。NO是重要的神經(jīng)遞質(zhì)和炎癥介質(zhì)，可以通過NOS/NO系統(tǒng)調(diào)節(jié)多種神經(jīng)遞質(zhì)釋放[17]。相關(guān)證據(jù)表明，情緒障礙與炎癥系統(tǒng)的激活和免疫系統(tǒng)的改變密切相關(guān)。抑郁癥患者血液中含有大量的炎性因子，可以引起抑郁不同的臨床表現(xiàn)。相關(guān)單核細胞研究發(fā)現(xiàn)，GSK3可以通過激活不同種類的Toll樣受體誘發(fā)炎癥反應(yīng)，也可促進前炎癥因子如IL-6、IL-1β、TNF-α的產(chǎn)生[18]。

綜上所述，藏紅花治療抑郁癥的作用機制主要通過調(diào)節(jié)神經(jīng)營養(yǎng)因子促進五羥色胺及多巴胺等神經(jīng)遞質(zhì)的合成；抑制炎癥因子釋放減緩炎癥反應(yīng)，改善抑郁狀態(tài)；調(diào)節(jié)體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)，保護中樞神經(jīng)系統(tǒng)，減緩抑郁癥發(fā)生發(fā)展的進程。本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學的角度闡述了藏紅花治療抑郁癥的作用機制，為藏紅花治療抑郁癥并進一步提高臨床療效提供了有效證據(jù)。