牟麗云，邢翔飛，陳重旭，張 晶，金桂蘭，奚 偉，陳劍鋒

(1. 三峽大學(xué)人民醫(yī)院，宜昌市第一人民醫(yī)院藥學(xué)部，湖北 宜昌 443000；2. 三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 宜昌 443002； 3. 三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點實驗室，湖北 宜昌 443002)

宮頸癌是一種常見的婦科惡性腫瘤，目前臨床上對其治療仍以手術(shù)和放化療為主，但化療所產(chǎn)生的耐藥性和腫瘤復(fù)發(fā)往往導(dǎo)致治療預(yù)期不佳。天然來源的藥物因其多靶點、毒性低的優(yōu)勢一直受到學(xué)者的重視。RCE-4是本實驗室從百合科鈴蘭族吉祥草植物中分離得到的一個螺甾烷型甾體皂苷，化學(xué)名稱為(1β,3β,5β,25S)-螺甾烷-1,3-diol1-[α-L-鼠李糖-(1→2)-β-D-木吡喃糖苷]，結(jié)構(gòu)見Fig 1，其在吉祥草總皂苷中的含量最高(達(dá)13%)，對宮頸癌Ca Ski細(xì)胞具有較好的選擇性細(xì)胞毒性[1]，能明顯抑制裸小鼠移植瘤生長，最高抑瘤率可達(dá)到69.1%，且對正常組織的毒性極低，顯示了其對宮頸癌治療的巨大潛力[2]，現(xiàn)已作為吉祥草的標(biāo)志性成分被湖北省地方中藥材標(biāo)準(zhǔn)收錄。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊或錯誤折疊的蛋白積累所導(dǎo)致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ER stress)是調(diào)節(jié)細(xì)胞適應(yīng)不利微環(huán)境的重要防御機(jī)制之一，在腫瘤細(xì)胞生長、存活、分化和維持蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)等過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。細(xì)胞周期阻滯同樣也是細(xì)胞在處于不利環(huán)境下的一種自我保護(hù)機(jī)制，為細(xì)胞提供額外的時間用于修復(fù)損傷[3]。已有研究證明，二者之間存在密切的聯(lián)系，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白合成廣泛性抑制，其中就包括細(xì)胞周期蛋白(cyclin)和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinases，CDK)等關(guān)鍵的細(xì)胞周期調(diào)控因子，從而誘發(fā)細(xì)胞周期阻滯[4-5]。反過來，細(xì)胞周期阻滯也是促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激使細(xì)胞恢復(fù)功能的機(jī)制之一，細(xì)胞周期阻滯不僅降低了應(yīng)激細(xì)胞的能量消耗，也為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的重構(gòu)提供了時間。

化療所觸發(fā)的腫瘤細(xì)胞自我保護(hù)機(jī)制是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性和腫瘤復(fù)發(fā)的重要原因，對其進(jìn)行深入研究有利于尋找規(guī)避途徑或指導(dǎo)臨床用藥。目前，關(guān)于RCE-4所觸發(fā)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞周期調(diào)控尚未見研究。本研究擬以宮頸癌Ca Ski細(xì)胞為對象，系統(tǒng)解析RCE-4對Ca Ski細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和周期阻滯的影響及其分子作用機(jī)制，為RCE-4將來的臨床應(yīng)用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞株 人宮頸癌Ca Ski細(xì)胞由中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫提供，本實驗室培養(yǎng)保存。

1.1.2藥物與試劑 RCE-4由本實驗室從吉祥草中分離并進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定；人抗兔一抗p21、p27、p53、p-p53、cdc25C、p-cdc25C、CyclinB1、Chk2、p-Chk2、ATM、Gadd45α、MDM2、PERK、eIF2α、p-eIF2α、ATF4、CHOP、β-actin，人抗鼠一抗CDK1均購自美國Cell Signaling Technology公司；二抗辣根酶標(biāo)記山羊抗小兔、山羊抗小鼠IgG( H + L)購自武漢塞維爾生物科技有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司(批號：2164175)；胎牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司(批號：18110506)；青霉素-鏈霉素混合液購自北京索萊寶科技有限公司(批號：20201011)；MTT購自美國Amersco公司；DMSO購自美國Sigma公司(批號：RNBG7127)；ECL超敏發(fā)光液購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司(批號：201900AP1020)；細(xì)胞周期檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司(批號：062719190909)。

1.1.3儀器 酶標(biāo)儀(瑞士TECAN公司)；流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；CO2培養(yǎng)箱(德國binder公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) Ca Ski細(xì)胞置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2MTT實驗 取對數(shù)生長期的Ca Ski細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個·L-1，接種于96孔板中，每孔100 μL。實驗分3組，每組5個復(fù)孔?？瞻捉M：不含細(xì)胞和RCE-4，僅含RPMI 1640完全培養(yǎng)基；對照組：含細(xì)胞、RPMI 1640完全培養(yǎng)基，但不含RCE-4；實驗組：含細(xì)胞、RPMI 1640完全培養(yǎng)基和RCE-4(終濃度為2、4、8、12、16 μmol·L-1)。分別培養(yǎng)24、48、72 h后棄培養(yǎng)基，每孔加入5 g·L-1MTT 20 μL，避光孵育4 h后每孔加入150 μL DMSO并劇烈溫震蕩10 min。用酶標(biāo)儀檢測490 nm波長處各孔的OD值。細(xì)胞抑制率/ %= (對照組吸光度-實驗組吸光度) /(對照組吸光度-空白孔吸光度)×100%。

1.2.3克隆形成實驗 取對數(shù)生長期細(xì)胞，鋪6孔培養(yǎng)板，每孔細(xì)胞約500 個，設(shè)置對照組、RCE-4(2、4、8、12、16 μmol·L-1)處理組，作用時間為1周，每2 d換液1次，藥物濃度保持不變。然后用PBS輕輕漂洗2次；甲醇固定30 min，PBS輕輕漂洗3次；結(jié)晶紫染色25min，PBS漂洗4-5次；晾干，相機(jī)拍照，ImageJ軟件計數(shù)。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 以每孔5.0×105個細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁之后，用不同濃度的RCE-4(0、8、12、16 μmol·L-1)處理24 h，胰酶消化收集細(xì)胞，用1× PBS重懸，并緩慢加入預(yù)冷的70%乙醇于4 ℃固定過夜。次日，離心洗去乙醇，加入RNase A消化，500 μL碘化丙啶(PI)試劑室溫避光孵育30 min，將樣品通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期檢測。實驗重復(fù)3次，采用Flow-jo7.6軟件進(jìn)行分析統(tǒng)計。

1.2.5Western blot檢測相關(guān)蛋白表達(dá) 分別收取經(jīng)不同方式處理的細(xì)胞，用含蛋白酶抑制劑的RIPA液裂解細(xì)胞后，12 000 r·min-1、4 ℃離心15 min，將上清轉(zhuǎn)移至新的EP管。用BCA法測定細(xì)胞裂解液中的蛋白濃度，取適量上清液(含50 μg蛋白)，加入1/4體積的5× loading buffer，100 ℃煮沸10 min。所得樣品經(jīng)SDS-PAGE分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。膜用10%脫脂牛奶( TBST配制)室溫封閉2 h后，TBST洗膜10 min×3次。加對應(yīng)一抗(稀釋比例為1 ∶1 000)4 ℃孵育過夜，TBST洗膜10 min×3次；再加二抗室溫孵育1 h(稀釋比例為1 ∶5 000)，TBST洗膜10 min×3次，最后用ECL化學(xué)發(fā)光法顯影并記錄結(jié)果。

2 結(jié)果

Fig 1 The chemical structure of RCE-4

2.1 RCE-4對人宮頸癌Ca Ski細(xì)胞的增殖抑制作用如Fig 2 MTT結(jié)果所示，RCE-4對人宮頸癌Ca Ski細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制效果，隨著RCE-4濃度的升高和作用時間的延長，抑制率逐漸增強(qiáng)，具有時間和濃度依賴性。作用24、48、72 h的IC50值分別為8.61、4.69、4.34 μmol·L-1。Fig 3克隆形成的實驗結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn)了RCE-4對人宮頸癌Ca Ski細(xì)胞增殖的抑制作用，與對照組相比，8、12、16 μmol·L-1RCE-4 組細(xì)胞克隆形成數(shù)目明顯減少，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

Fig 2 Effects of different concentrations of RCE-4 on proliferation of cervical cancer Ca Ski cells after treatment for 24 h, 48 h and 72 h respectively n=3) **P<0.01 vs control.

2.2 RCE-4對PERK/eIF2α/ATF4/CHOP通路的影響PERK/eIF2α/ATF4/CHOP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激主要的信號通路之一。Western blot的結(jié)果顯示(Fig 4A-C)，不同濃度的RCE-4分別作用于Ca Ski細(xì)胞6 h、12 h、24 h后，與對照組相比，PERK、p-eIF2α、ATF4和CHOP的表達(dá)水平均明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而eIF2α的表達(dá)水平基本無明顯變化。

Fig 3 Effects of different concentrations of RCE-4 on colony formation of Ca Ski cells n=3) **P<0.01 vs control

2.3 RCE-4促進(jìn)Ca Ski細(xì)胞周期阻滯于G2/M期CDK1與CyclinB1是細(xì)胞周期G2/M期檢查點的關(guān)鍵蛋白。Western blot的結(jié)果顯示(Fig 5A-C)，不同濃度的RCE-4分別作用于Ca Ski細(xì)胞6 h、12 h、24 h后，與對照組相比，CDK1與CyclinB1的表達(dá)水平均被明顯抑制，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。Fig 6流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，與對照組相比，RCE-4(8、12、16 μmol·L-1)處理Ca Ski細(xì)胞24 h后，G2/M期細(xì)胞數(shù)量由8.05%分別增加至13.76%、19.53%、27.50%，S期細(xì)胞數(shù)量由39.44%分別降低至30.55%、30.96%、28.86%。結(jié)果表明隨著RCE-4濃度的增加，Ca Ski細(xì)胞G2/M期細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，S期細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，細(xì)胞被阻滯于G2/M期。

2.4 RCE-4對ATM/Chk2/cdc25C信號通路的影響考慮到ATM/Chk2/cdc25C信號傳導(dǎo)通路在G2/M期的轉(zhuǎn)化中起著重要作用，我們研究了該通路中相關(guān)分子蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。Western blot結(jié)果顯示(Fig 7A-C)，不同濃度的RCE-4分別作用于Ca Ski細(xì)胞6 h、12 h、24 h后，與對照組相比，ATM的蛋白表達(dá)水平明顯升高，而Chk2、p-Chk2、cdc25C、p-cdc25C的表達(dá)均被明顯抑制，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

Fig 4 Effects of different concentrations of RCE-4 on PERK-eIF2α pathway proteins expression at 6 h, 12 h and 24 h n=3) *P<0.05，**P<0.01 vs control.

Fig 5 Effects of different concentrations of RCE-4 on CDK1 and CyclinB1 protein expression at 6 h, 12 h, 24 n=3) **P<0.01 vs control.

2.5 RCE-4對p21、p27及其他細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的影響Western blot結(jié)果顯示(Fig 8A-C)，不同濃度的RCE-4分別作用于Ca Ski細(xì)胞6 h、12 h、24 h后，與對照組相比，RCE-4明顯提高了Ca Ski細(xì)胞中p21和p27蛋白的表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而p53、p-p53蛋白水平均下調(diào)。提示RCE-4可能通過非p53依賴途徑上調(diào)p21和p27，并將Ca Ski細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，從而抑制Ca Ski細(xì)胞的生長。此外，參與調(diào)控細(xì)胞周期的其他基因—MDM2和GADD45α的蛋白表達(dá)水平均下調(diào)(P<0.05)。

Fig 6 Effects of different concentrations of RCE-4 on cell cycle distribution of Ca Ski cells for 24 h n=3) *P<0.05 vs control.

Fig 7 Effects of different concentrations of RCE-4 on ATM/Chk2/cdc25C signaling pathway at 6 h, 12 h and 24 n=3) *P<0.05 vs control

3 討論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成、加工、分泌及質(zhì)量監(jiān)控的關(guān)鍵細(xì)胞器，細(xì)胞通過未折疊蛋白效應(yīng)(unfolded protein response, UPR)感應(yīng)外界不同刺激引發(fā)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，在維持細(xì)胞功能穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。PERK/eIF2α是UPR效應(yīng)主要的信號通路之一，在外界刺激下，人蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R-like ER kinase，PERK)二聚化并通過反式自磷酸化的方式激活，進(jìn)而使α亞基真核起始因子2(α subunit of eukaryotic initiation factor 2，eIF2α)的51位絲氨酸磷酸化，同時，激活轉(zhuǎn)錄因子4(activating transcription factor 4，ATF4)在eIF2α功能受限時被優(yōu)先翻譯，并激活轉(zhuǎn)錄因子CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding homologous protein，CHOP)的轉(zhuǎn)錄，以此激活下游UPR靶基因的表達(dá)，抑制蛋白翻譯和折疊[6-7]。ATF4和CHOP的高水平表達(dá)會導(dǎo)致持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而影響細(xì)胞生長、周期阻滯及細(xì)胞凋亡等多種生物學(xué)過程[8-9]。目前已有研究指出，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和隨后的UPR可誘導(dǎo)細(xì)胞周期G2/M期阻滯，且此過程與PERK/eIF2α信號傳導(dǎo)途徑有關(guān)[4-5]。

Fig 8 Effects of RCE-4 on cell cycle related proteins such as p21 and p27 at 6 h, 12 h and 24 h n=3) *P<0.05,**P<0.01 vs control

本實驗中，RCE-4以不同的濃度和時間處理Ca Ski細(xì)胞后，Western blot結(jié)果顯示PERK、p-eIF2α、ATF4、CHOP的蛋白表達(dá)水平均明顯升高，說明RCE-4觸發(fā)了Ca Ski細(xì)胞持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。進(jìn)一步，CyclinB1與CDK1的表達(dá)均被明顯抑制，推測Ca Ski細(xì)胞周期調(diào)控受到影響。細(xì)胞周期的調(diào)控是通過細(xì)胞周期各時相中各自特異性的細(xì)胞周期蛋白實現(xiàn)，其中Cyclin、CDKs和CDK抑制蛋白(cyclin-dependent kinase inhibitors，CDKIs)是參與細(xì)胞周期調(diào)控的主要因子[10]。CyclinB1與CDK1是調(diào)控細(xì)胞周期G2/M期的核心蛋白，對細(xì)胞周期調(diào)控至關(guān)重要。在S期末期，CyclinB1開始合成并作為調(diào)節(jié)亞基與CDK1結(jié)合為有絲分裂促進(jìn)因子(mitosis-promoting factor，MPF)，驅(qū)動G2到M期的轉(zhuǎn)換[11-12]。流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果驗證了我們的推測，不同濃度和時間的RCE-4處理Ca Ski細(xì)胞后，處于G2/M期的細(xì)胞數(shù)量明顯上升，表明RCE-4可將Ca Ski的細(xì)胞周期阻滯在G2/M期。

考慮到ATM/Chk2/cdc25C信號傳導(dǎo)通路對G2/M期阻滯的重要作用，我們研究了RCE-4對該通路相關(guān)蛋白的影響。該信號通路能以級聯(lián)反應(yīng)順次磷酸化，最終激活cdc25C分子，從而激活CyclinB1/CDK1復(fù)合體，促進(jìn)細(xì)胞周期G2/M期的轉(zhuǎn)化[13]。cdc25C的降解是維持G2/M期阻滯的必要條件[14]。實驗結(jié)果顯示，RCE-4處理之后ATM被激活，Chk2的表達(dá)及其磷酸化過程被抑制，并最終導(dǎo)致cdc25C及磷酸化的cdc25C均被降解，Ca Ski被阻滯于G2/M期。p21和p27是主要的CDK抑制蛋白(CDKIs)，其活性可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子ATF4和CHOP介導(dǎo)，競爭性抑制CyclinB1或者CyclinB1/CDK1復(fù)合物，抑制細(xì)胞從G2期進(jìn)入M期[15-17]。Western blot結(jié)果顯示，不同濃度和時間的RCE-4處理CaSki細(xì)胞后，p21和p27的表達(dá)均被明顯抑制，表明RCE-4所觸發(fā)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過p21和p27介導(dǎo)，將CaSki的細(xì)胞周期阻滯在G2/M期。然而，RCE-4誘導(dǎo)的G2/M期周期阻滯并不依賴與p53的參與，因為p53和磷酸化的p53(p-p53)的表達(dá)在處理過程中是都下降的。MDM2是p53下游的靶基因，已被證明以一種不依賴p53的方式負(fù)調(diào)控p21蛋白水平，MDM2基因沉默時，Cdc25C基因表達(dá)受到抑制，延遲細(xì)胞周期在G2/M期的進(jìn)展[18]；GADD45α是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的生長阻滯的關(guān)鍵介質(zhì)，通過eIF2信號通路調(diào)控G2/M過渡和細(xì)胞死亡[5]，本實驗中，經(jīng)RCE-4處理的Ca Ski細(xì)胞中MDM2和GADD45α的蛋白表達(dá)水平均下調(diào)，提示RCE-4誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與細(xì)胞周期阻滯可能與GADD45α和MDM2等分子的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，RCE-4通過上調(diào)PERK/eIF2α/ATF4/CHOP通路激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，并以p21、p27、MDM2、GADD45α等分子為介導(dǎo)，調(diào)控ATM/Chk2/cdc25C信號通路，誘導(dǎo)Ca Ski細(xì)胞阻滯于G2/M期。對RCE-4所誘導(dǎo)的兩種細(xì)胞自我保護(hù)機(jī)制的解析，可為RCE-4將來的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。