胡丹東， 崔玉娟, 張 繼

(1.北京市延慶區(qū)食品藥品安全監(jiān)控中心，北京 102100；2.西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070； 3. 北京市延慶區(qū)疾病預(yù)防控制中心，北京 102100)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種常見的慢性、炎癥性和進(jìn)行性自身免疫性疾病。RA患者的早期病理特征主要是滑膜炎和關(guān)節(jié)腔內(nèi)血管翳的形成[1]。慢性炎癥促進(jìn)RA的發(fā)展，在發(fā)展過程中巨噬細(xì)胞的極化、成纖維樣滑膜細(xì)胞的異常增殖、炎性因子等原因?qū)е玛P(guān)節(jié)軟骨的破壞和周圍組織的損傷[2]。如果患者得不到及時(shí)、正規(guī)的治療，就會(huì)造成關(guān)節(jié)畸形，甚至最終發(fā)展為肢體殘疾。此外，RA患者易合并腦卒中、心肌梗死等疾病，是致殘的主要原因，在一定程度上導(dǎo)致社會(huì)勞動(dòng)的喪失[3]。 根據(jù)流行病學(xué)資料，全世界RA發(fā)病率約為1%[4]，因此，RA已成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。

在現(xiàn)代治療的幫助下，大多數(shù)RA患者可以有效地控制病情，改善癥狀，減輕疼痛，保護(hù)關(guān)節(jié)功能[5]。 但到目前為止，還沒有治療RA的特效藥，治療方法主要包括藥物治療、物理治療、手術(shù)治療和免疫吸附治療，其中，藥物治療作為應(yīng)用最廣泛和最有效的方法，在RA的治療中起著關(guān)鍵作用[6]。亞油酸是一種功能性的多不飽和脂肪酸，據(jù)報(bào)道其具有降低血清膽固醇水平、抑制動(dòng)脈血栓形成、預(yù)防癌癥、參與人類心血管疾病的控制、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞生長和細(xì)胞凋亡等作用。此外，亞油酸用于治療關(guān)節(jié)和肌肉的炎癥和疼痛[7]。還有文獻(xiàn)報(bào)道，亞油酸可促進(jìn)傷口愈合，減少傷口愈合過程中的炎癥細(xì)胞數(shù)量，并顯著抑制炎癥因子水平[8]。然而，亞油酸在RA治療中的潛在作用和可能機(jī)制尚未闡明。

RA的病因尚不清楚，但已發(fā)現(xiàn)NF-κB信號(hào)通路在RA的發(fā)展中具有重要作用，相關(guān)研究表明可以通過抑制NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮抗RA作用[9]。此外，近年來TLR4已被發(fā)現(xiàn)對(duì)RA的病理反應(yīng)有重要影響，其作用機(jī)制與RA患者滑膜中TLR4的表達(dá)水平高于健康人有關(guān)[10]；隨著研究的不斷深入，姜黃素、青藤堿等植物提取物均可通過阻斷或抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路減輕和預(yù)防炎癥反應(yīng)，改善RA，成為治療RA的潛在藥物。因此，TLR4/NF-κB信號(hào)通路在RA的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。

因此，本研究旨在探討亞油酸在治療RA中的作用及其可能的機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)亞油酸通過抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路減輕炎癥反應(yīng)，改善膠原誘導(dǎo)的RA，研究結(jié)果為亞油酸在RA中的生物學(xué)功能提供了新的認(rèn)識(shí)，并為RA的治療提供了一種新的藥物。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物從上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心(中國)購買的36只體質(zhì)量為(250-300)g的雄性SD大鼠。所有動(dòng)物都被安置在控制溫度(22 ℃)、濕度(50%)和光照(12 h光照/黑暗)下，自由獲得標(biāo)準(zhǔn)飲食和水。

1.2 大鼠RA模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組RA大鼠模型的建立，將Ⅱ型膠原溶解于0.05 mol·L-1醋酸溶液中，配成濃度為2 g·L-1的溶液，等體積加入膠原溶液與完全弗氏佐劑乳化，采用免疫注射法在尾根部皮內(nèi)注射100 μg膠原乳劑，在d 7加強(qiáng)免疫。將SD大鼠分為6組，每組6只，包括：對(duì)照組、RA模型組、RA+亞油酸(0.1 mL)組、RA+亞油酸(0.2 mL)組、RA+亞油酸(0.4 mL)組和RA+甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)(20 mg·kg-1)組。對(duì)照組和模型組只給予0.9%生理鹽水，其他組給予各體積亞油酸及10 mL·kg-1MTX處理，連續(xù)灌胃7 d。然后處死大鼠，分別在不同時(shí)間測(cè)定各組大鼠的關(guān)節(jié)腫脹、足體積、足厚、關(guān)節(jié)周長。亞油酸(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111622-201704、含量：99.8%、規(guī)格：0.2 mL/支)、MTX(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100138-201606、含量：99.8%、規(guī)格：400 mg/支)。

1.3 HE染色關(guān)節(jié)軟骨組織固定于4%多聚甲醛，石蠟包埋，切片厚4 μm，用蘇木精染色10 min，室溫用伊紅處理5 min，組織學(xué)圖像在光學(xué)顯微鏡下放大200倍獲得。CX43光學(xué)顯微鏡(奧林巴斯株式會(huì)社，日本)。

1.4 ELISA檢測(cè)采集血清樣本，分析細(xì)胞因子釋放情況。300 g血清在4 ℃下離心(2 000-3 000 r·min-1)15 min，收集上清液。用ELISA法檢測(cè)血清樣本中的IL-1、IL-6、TNF-α和IL-10蛋白水平。ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，中國)，MK3酶標(biāo)儀(美國熱電公司，美國)。

1.5 qRT-PCR用TRIzol(碧云天生物技術(shù)研究所，中國)法從關(guān)節(jié)軟骨組織中提取總RNA，用TaqMan一步法將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。通過ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，美國)進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。用2-ΔΔCt法計(jì)算IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-10的相對(duì)mRNA表達(dá)水平。以GAPDH為內(nèi)標(biāo)，特異性引物如Tab 1所示：

Tab 1 Specific primer sequence, forward and reverse primer sequences of IL-1β, IL-6, TNF-α, IL-10, GAPDH

反應(yīng)體系為：2×SYBR?Green Realtime PCR預(yù)混液12.5 μL、正向引物1 μL、反向引物1 μL、cDNA模版2 μL，加ddH2O至25 μL。循環(huán)為：95 ℃變性5 min；95 ℃持續(xù)15 s、55 ℃持續(xù)15 s、72 ℃持續(xù)10 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

1.6 Western blot檢測(cè)用RIPA裂解緩沖液分離關(guān)節(jié)軟骨組織中的蛋白質(zhì)，BCA試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所，中國)定量。再用12%SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(Millipore，MA，美國)。然后，用5%脫脂乳封閉膜，并在4 ℃下過夜，用抗TLR4(1 ∶1 000，ab22048)、抗p-NF-κB p65(1 ∶1 000，ab86299)、抗NF-κB p65(1 ∶1 000，ab16502)和抗GAPDH(1 ∶2 000，ab181602)等一抗處理。用HRP結(jié)合二次抗體(1 ∶2 000，ab6728)在室溫下沖洗1 h。最后，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒(ECL，Millipore，Bedford，MA，美國)觀察蛋白質(zhì)印跡。所有抗體均來自Abcam(MA，美國)。

1.7 免疫組織化學(xué)法用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片5 μm。用TLR4(1 ∶100，ab22048)、p-NF-κB p65(1 ∶100，ab86299)抗體對(duì)組織進(jìn)行免疫染色。然后用生物素標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白G二次抗體孵育，在37 ℃下1 ∶500稀釋，再次孵育30 min，用DAB作顯色劑。圖像在光學(xué)顯微鏡下獲取，CX43光學(xué)顯微鏡(奧林巴斯，日本)；所有抗體均來自Abcam (MA，美國)。

2 結(jié)果

2.1 亞油酸對(duì)RA大鼠關(guān)節(jié)腫脹的影響構(gòu)建Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的RA大鼠模型，通過不同劑量亞油酸和MTX的處理，探討亞油酸對(duì)RA大鼠關(guān)節(jié)腫脹的影響。如Fig 1A所示，Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的RA大鼠關(guān)節(jié)與對(duì)照組相比腫脹明顯，而亞油酸顯著改善了RA大鼠的關(guān)節(jié)腫脹。此外，還測(cè)量了不同組在相應(yīng)天數(shù)下的足部體積、足部厚度和關(guān)節(jié)周長，如Fig 1B-D所示，RA大鼠足部體積、足部厚度和關(guān)節(jié)周長數(shù)據(jù)明顯大于對(duì)照組，而經(jīng)過亞油酸處理后都得到了顯著改善(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，亞油酸有效改善了Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的大鼠RA導(dǎo)致的關(guān)節(jié)腫脹。

2.2 亞油酸對(duì)RA大鼠關(guān)節(jié)病理損傷的影響對(duì)不同分組的RA大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織進(jìn)行了HE檢測(cè)。如Fig 2A所示，對(duì)照組大鼠關(guān)節(jié)軟骨表面光滑，層次完整，滑膜下層細(xì)胞分散且少，無炎癥或骨質(zhì)破壞。而RA大鼠關(guān)節(jié)部位表現(xiàn)出典型的病理特征，如滑膜細(xì)胞顯著增加、滑膜增生、伴有炎性細(xì)胞浸潤和血管翳形成，關(guān)節(jié)軟骨和骨嚴(yán)重破壞，經(jīng)亞油酸處理后明顯減輕了RA大鼠的上述現(xiàn)象。 結(jié)果表明亞油酸可改善RA大鼠關(guān)節(jié)病理損傷。

Fig 1 Effects of linoleic acid on joint swelling in RA rats n=6)

Fig 2 Effects of linoleic acid on joint pathological injury in RA rats n=6)

2.3 亞油酸對(duì)RA大鼠炎癥反應(yīng)的影響采用ELISA法檢測(cè)TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10等炎性因子的表達(dá)水平。如Fig 3A所示，與對(duì)照組相比，Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的RA大鼠TNF-α等炎性因子表達(dá)量明顯增加，而與模型組相比，亞油酸處理后抑制RA大鼠炎性因子表達(dá)(P<0.05)。同時(shí)，qRT-PCR對(duì)炎性因子的mRNA測(cè)定也得到了相同的結(jié)果，如Fig 3B所示，與模型組相比，隨著亞油酸的增加明顯降低了Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的mRNA表達(dá)水平。這些數(shù)據(jù)表明亞油酸能改善RA大鼠的炎癥反應(yīng)。

2.4 亞油酸對(duì)RA大鼠TLR4/NF-κB信號(hào)通路表達(dá)的影響采用免疫組化和Western blot方法檢測(cè)亞油酸對(duì)TLR4/NF-κB信號(hào)通路表達(dá)的影響。如Fig 4A所示，亞油酸劑量的增加抑制了TLR4/NF-κB信號(hào)通路蛋白TLR4和p-p65在組織中的陽性產(chǎn)物表達(dá)；Fig 4B所示亞油酸抑制了TLR4/NF-κB信號(hào)通路TLR4的表達(dá)以及p65蛋白的磷酸化，通過免疫組織化學(xué)法和Western blot的檢測(cè)結(jié)果可以明顯看到抑制趨勢(shì)(P<0.05)。結(jié)果顯示亞油酸抑制RA大鼠TLR4/NF-κB信號(hào)通路的表達(dá)，通過調(diào)節(jié)TLR4/NF-κB信號(hào)通路改善Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的大鼠RA。

Fig 3 Effects of linoleic acid on inflammatory response in RA rats n=6)

Fig 4 Effects of linoleic acid on expression levels of TLR4/NF-κB signaling pathway in articular cartilage tissues of RA rats n=6)

3 討論

近年來，RA的臨床治療取得了很大進(jìn)展，主要體現(xiàn)在生物改良抗風(fēng)濕藥物和小分子靶向抑制劑，包括TNF抑制劑、IL-6抑制劑、抗T細(xì)胞共刺激藥物、抗B細(xì)胞藥物等，盡管這些生物制劑的作用靶點(diǎn)不同，但研究人員發(fā)現(xiàn)這些藥物最終都是通過干擾RA的炎癥進(jìn)程發(fā)揮作用[11]。雖然近年來RA的治療取得了很大的進(jìn)展，但目前這些治療藥物只能部分緩解病情的進(jìn)展，在RA的治療方面仍然存在巨大的挑戰(zhàn)，這說明開發(fā)和篩選新的治療藥物仍然具有重要意義。植物提取物具有資源豐富、細(xì)胞毒性相對(duì)較小、易獲得、成本低廉等諸多積極優(yōu)勢(shì)。因此，本研究旨在探討亞油酸在RA發(fā)生發(fā)展過程中的可能作用及其機(jī)制，體內(nèi)研究表明亞油酸能明顯改善關(guān)節(jié)腫脹、足部體積、足部厚度，RA大鼠關(guān)節(jié)周長及關(guān)節(jié)病理損傷。

RA是一種自身免疫性疾病，其基本病理改變?yōu)榛ぱ譡12]。研究表明，RA活動(dòng)期血清和滑膜中炎性細(xì)胞因子的表達(dá)發(fā)生了變化，這些細(xì)胞因子中最重要的是TNF-α和IL-1β，它們通常同時(shí)存在于炎性細(xì)胞中，并且相互作用，其主要機(jī)制是激活血管內(nèi)皮細(xì)胞，增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子的表達(dá)，從而聚集關(guān)節(jié)腔中的白細(xì)胞發(fā)揮炎癥作用，引起相應(yīng)的臨床癥狀和的軟骨破壞[13]，同時(shí)炎性反應(yīng)可刺激TNF-α和IL-1β的合成，從而形成惡性循環(huán)。TNF-α主要影響滑膜炎的嚴(yán)重程度，而IL-1β對(duì)軟骨破壞有更大的影響，IL-6和IL-10也與RA的進(jìn)展密切相關(guān)[14]。所以，TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10作為觀察指標(biāo)可以客觀、系統(tǒng)地反映RA的病情。因此，本研究進(jìn)行了ELISA和qRT-PCR檢測(cè)，數(shù)據(jù)顯示亞油酸可抑制Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的RA大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的蛋白表達(dá)水平和mRNA表達(dá)水平。

NF-κB信號(hào)通路在RA的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，因此受到越來越多的關(guān)注[15]。NF-κB是一種多效性核轉(zhuǎn)錄因子，存在于幾乎所有類型細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，通常以非活性形式存在，在細(xì)胞活化、淋巴細(xì)胞發(fā)育、應(yīng)激反應(yīng)、凋亡等細(xì)胞活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。NF-κB的激活可提高TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、粘附分子、G-CSF和COX-2的轉(zhuǎn)錄水平，同時(shí)對(duì)TNF-α、IL-1β等多種炎癥介質(zhì)進(jìn)行正調(diào)控和促進(jìn)[16]，而TNF-α和IL-1β可進(jìn)一步激活NF-κB的表達(dá)，從而形成惡性循環(huán)，并導(dǎo)致RA反應(yīng)和結(jié)構(gòu)損傷的維持和進(jìn)展[17]，因此，阻斷RA患者病理狀態(tài)下NF-κB的激活可以下調(diào)炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，從而阻斷RA的發(fā)展。最近的研究表明TLR4與RA的進(jìn)展和發(fā)展密切相關(guān)，并在RA患者中高度表達(dá)[18]，TLR4一種I型跨膜蛋白，并表達(dá)于多種組織細(xì)胞中，并通過 NF-κB途徑啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。TLR4/NF-κB信號(hào)通路是RA發(fā)病過程中重要的炎癥相關(guān)通路之一，細(xì)胞膜上的TLR4將信號(hào)傳遞給細(xì)胞質(zhì)中的NF-κB、p65，激活NF-κB二聚體從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核的易位，指導(dǎo)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，促進(jìn)細(xì)胞分泌下游產(chǎn)物，進(jìn)一步影響RA的進(jìn)展和發(fā)展，TLR4/NF-κB信號(hào)通路已被證明是RA治療的靶向途徑。在本研究中，通過免疫組化法發(fā)現(xiàn)亞油酸抑制RA大鼠TLR4/NF-κB信號(hào)通路中TLR4和p-p65的表達(dá)，同時(shí)WB檢測(cè)也得到了相同的結(jié)果。

總之，亞油酸能夠抑制RA導(dǎo)致的炎性反應(yīng)，其機(jī)制與亞油酸能通過抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路TLR4和p-p65的蛋白表達(dá)水平，進(jìn)而抑制炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10的表達(dá)有關(guān)，通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)了亞油酸通過抑制炎癥反應(yīng)和阻斷TLR4/NF-κB信號(hào)通路對(duì)RA具有潛在的治療作用。因此，為亞油酸可能成為RA治療藥物提供了依據(jù)。