張強(qiáng)， 羅彩云， 孫達(dá)權(quán)， 曾志銳， 鄭志菊， 徐國強(qiáng),3**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 貴州 貴陽 550025； 2.貴陽市第二人民醫(yī)院 手術(shù)室， 貴州 貴陽 550023； 3.貴州醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院 醫(yī)學(xué)研究中心， 貴州 都勻 558000)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界上最常見的人類惡性腫瘤之一，每年約有80萬人因HCC而死亡，是死亡率較高的腫瘤[1]。近幾年來肝癌患者通過手術(shù)切除、器官移植和化學(xué)治療等方法有效地延長(zhǎng)生命，然而即使經(jīng)過有效的治療，患者的總體生存率依舊較差，其1年和3年生存率分別為20%和5%，其中腫瘤的高復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率仍是導(dǎo)致HCC死亡的主要原因[2]。因此對(duì)HCC復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移發(fā)病的機(jī)制研究、尋求最佳分子療法的靶標(biāo)，可望成為有效治療肝癌新的希望。Nedd4家族交互作用蛋白2(Nedd4 family interacting protein 2，Ndfip2)是Nedd4家族交互作用蛋白中的一員，可與Nedd4家族成員結(jié)合，能夠激活E3泛素連接酶，影響泛素化進(jìn)行。研究發(fā)現(xiàn)Nedd4在腫瘤細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程中起著至關(guān)重要的作用，Nedd4的下調(diào)導(dǎo)致EMT表型部分回復(fù)到間充質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化(MET)表型特性，在腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過程中起關(guān)鍵作用[3]。為了進(jìn)一步探究Ndfip2對(duì)肝癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化En Vision染色法和蛋白印跡法檢測(cè)Ndfip2在肝癌組織和和肝癌細(xì)胞SMMC-7721、HepG2中的表達(dá)，通過Ndfip2 小干擾RNA(small interfering RNA，si-Ndfip2)靶向沉默肝癌細(xì)胞中Ndfip2的表達(dá)，探究Ndfip2對(duì)肝癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響及作用機(jī)制，為肝癌的治療提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及試劑

1.1.1細(xì)胞株 人正常肝細(xì)胞株LO2、人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721和HepG2均購自中國科學(xué)院昆明細(xì)胞庫。

1.1.2肝癌及其癌旁組織標(biāo)本 病理科生物樣本庫中16例肝癌手術(shù)患者(未經(jīng)化療)的肝癌及其癌旁組織(距離肝癌組織邊緣2 cm處)標(biāo)本，收集樣本進(jìn)行研究之前，獲得患者簽署知情同意，本研究得到醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.3試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基(批號(hào)8121283)和青-鏈霉素購自美國HyClone公司，新生牛血清(FBS) 購自四季青公司(批號(hào)20010503)，二甲基亞砜(DMSO)購自Sigma公司，PVDF膜購自Millipore公司(批號(hào)R0BB23468)，SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購自北京索萊寶生物公司，BCA蛋白濃度定量試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)公司(批號(hào)20200519)，RIPA裂解液和PMSF酶抑制劑購自武漢博士德生物公司(批號(hào)20200804)，高敏ECL曝光液購自上海碧云天生物技術(shù)公司(批號(hào)P0018AS-2)，兔抗人Nedd4家族交互作用蛋白2(Nedd4 family interacting protein 2，Ndfip2)多克隆抗體購自美國Affinity公司(批號(hào)DF2596)，兔抗人E-鈣黏蛋白(E-cadherin,批號(hào)AF0131)、兔抗人N-鈣黏蛋白(N-cadherin,批號(hào)BS2224)、兔抗人波形蛋白(Vimentin)多克隆抗體購自武漢三鷹公司(批號(hào)10366-1-AP)，兔抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ，GAPDH)多克隆抗體購自巴傲得生物科技有限公司(批號(hào)YM32215)，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(二抗)購自武漢三鷹公司(批號(hào)AA122028)，si-RNA Ndfip2序列由上海吉瑪基因公司合成，LipofectamineTM 2000購自美國Invitrogen公司(批號(hào)2150081)。

1.2 方法

1.2.1Ndfip2表達(dá) 肝癌組織和癌旁組織標(biāo)本采用EnVision染色法，染色嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。每張切片由兩位病理醫(yī)師在高倍鏡(×400)隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行單獨(dú)評(píng)分：染色強(qiáng)度分為0分(陰性)、1分(弱陽性)、2分(陽性)、3分(強(qiáng)陽性)，特異性陽性染色分為0分(<5%)、1分(6%～25%)、2分(26%～50%)、3分(51%～75%)和4分(>75%)；最終分?jǐn)?shù)為染色強(qiáng)度得分和特異性陽性染色得分乘積表示， 0～4分為基因低表達(dá)組、 4分以上為高表達(dá)組。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) 人正常肝細(xì)胞株LO2、人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721和HepG2用RPMI-1640培養(yǎng)基(10%FBS、1%青-鏈霉素)、37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合率為70%～80%時(shí)，用0.25%胰酶消化并傳代、進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)，此4種細(xì)胞均為貼壁生長(zhǎng)。

1.2.3Ndfip2 si-RNA轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞 將細(xì)胞按1×106個(gè)/孔，鋪于12孔板待長(zhǎng)到50%～70%時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前2 h將12孔換成新鮮無血清RPMI-1640培養(yǎng)基，取siRNA(1 D)，瞬時(shí)離心后加入DEPC125 μL處理水配成工作溶液。取兩個(gè)1.5 mL離心管，一管加入4 μL Lipo2000與無血清RPMI-1640培養(yǎng)基200 μL后混勻、另一管加入4 μL siRNA與200 μL無血清RPMI-1640培養(yǎng)基后混勻，室溫靜置5 min，混勻上述兩個(gè)離心管中的液體，室溫靜置20 min，實(shí)驗(yàn)組中每孔各加入204 μL混合液，然后每孔補(bǔ)充796 μL無血清RPMI-1640培養(yǎng)基；繼續(xù)培養(yǎng)6 h后換成含20 % FBS的新鮮RPMI-1640培養(yǎng)基。Ndfip2特異性si-RNA的正義鏈序列為5′-GGAAGAGUGUCCACCAACATT-3，反義鏈序列為5′-UCUUGGUGGACACUCUUCCTT-3′；陰性對(duì)照的正義鏈序列為5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3′，反義鏈序列為5′-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3′。

1.2.4實(shí)驗(yàn)分組 SMMC-7721細(xì)胞的 Ndfip2-siRNA沉默對(duì)照組(NC)和Ndfip2沉默組(si-Ndfip2)，HepG2細(xì)胞的Ndfip2-siRNA沉默對(duì)照組(NC)和Ndfip2沉默組(si-Ndfip2)。

1.2.5劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝癌細(xì)胞的遷移 將轉(zhuǎn)染完成的各組細(xì)胞按每孔1×106個(gè)細(xì)胞鋪于12孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至100 %密度時(shí)在孔中央使用10 μL的無菌槍頭做“十字”劃痕，PBS清洗3次以去掉懸浮的細(xì)胞，加入不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)液1 mL繼續(xù)培養(yǎng)，分別在0即刻、24 h于顯微鏡下觀察細(xì)胞的狀態(tài)并拍照。采用Image J軟件測(cè)量遷移面積，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)算細(xì)胞遷移率，細(xì)胞遷移率(%)=(總面積-空白面積)/總面積×100%。

1.2.6Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲 遷移實(shí)驗(yàn)：收集轉(zhuǎn)染完成的各組細(xì)胞，按每室1×105個(gè)細(xì)胞制成無血清RPMI-1640懸液200 μL，鋪于8 μm孔徑Transwell小室，后將小室移至含10% 血清培養(yǎng)液600 μL的下室中，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞；48 h時(shí)取出，用4 %的多聚甲醛溶液固定細(xì)胞10 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min、雙蒸水沖洗浸泡數(shù)次，輕柔去除上層的細(xì)胞。經(jīng)烘箱干燥后，置于光學(xué)顯微鏡40倍鏡下隨機(jī)采集5個(gè)視野細(xì)胞計(jì)數(shù)，以此表示細(xì)胞遷移能力。侵襲實(shí)驗(yàn)：預(yù)先以4 ℃預(yù)冷的無血清RPMI-1640培養(yǎng)基和Matrigel按11 ∶1的體積比例稀釋后，每孔100 μL，均勻鋪在上室，放入培養(yǎng)箱中靜置2 h使其干成膠狀；取出小室，棄上清液后加PBS于上室和下室平衡15 min，然后除去PBS，剩余步驟同Transwell遷移實(shí)驗(yàn)。

1.2.7Western blot檢測(cè)Ndfip2、E-cadherin、Vimentin、N-cadherin表達(dá) 收集各組細(xì)胞，經(jīng)RIPA裂解液裂解，使用BCA定量法進(jìn)行定量，配制10%的SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳，每孔蛋白上樣量為10 μL；將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，37 ℃、5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗(兔抗人Ndfip2、E-cadherin、Vimentin、N-cadherin)4 ℃孵育過夜、洗膜(1×TBST，3次，5 min/次)，二抗[辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔(所有二抗體積稀釋度均為1 ∶2 000)]室溫孵育2 h、洗膜，在膜上均勻鋪上曝光液ECL，在凝膠成像系統(tǒng)內(nèi)測(cè)定結(jié)果，用Quantity One系統(tǒng)分析目的條帶并獲取目的條帶的灰度值進(jìn)行分析。本實(shí)驗(yàn)使用GAPDH作為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)化的內(nèi)參，用目的蛋白的灰度值與內(nèi)參蛋白的灰度值的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Ndfip2表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示，與癌旁組織比較，肝癌組織中Ndfip2表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1A～B。蛋白印跡法結(jié)果顯示，與正常肝細(xì)胞LO2比較，Ndfip2在肝癌細(xì)胞SMMC-7721、HepG2表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1C～D。

注：A、B為Ndfip2在肝癌組織和癌旁組織的表達(dá)(1HC，×400)，(1)與癌旁組織比較，P<0.05；C、D為Ndfip2在正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞中的表達(dá)(Western blot)，(1)與LO2細(xì)胞比較，P<0.05。圖1 Ndfip2在肝癌組織和細(xì)胞株中的表達(dá)Fig.1 The expression of Ndfip2 in HCC tissues and cell strains

2.2 Ndfip2低表達(dá)細(xì)胞株

Western blot法結(jié)果顯示，si-Ndfip2組SMMC-7721和HepG2細(xì)胞中的Ndfip2的表達(dá)水平較NC組細(xì)胞顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2A～C。提示Ndfip2低表達(dá)肝癌細(xì)胞株構(gòu)建成功。

注：A、B為Western blot條帶灰度結(jié)果，C為相對(duì)定量結(jié)果； (1)與NC組比較，P<0.05。圖2 SMMC-7721和HepG2細(xì)胞的Ndfip2低表達(dá)細(xì)胞株(Western blot)Fig.2 SMMC-7721 and HepG2 cells with low expression of Ndfip2 (Western blot)

2.3 Ndfip2對(duì)肝癌細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與NC組比較，si-Ndfip2組SMMC-7721和HepG2細(xì)胞的遷移面積均減小, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3A～B。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與NC組比較，si-Ndfip2組SMMC-7721和HepG2細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)及侵襲細(xì)胞數(shù)均減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3C～F。

注：A 、B為劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果(×40)，C、D為Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果(×40)，E、F為Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果(×40)；(1)與NC組比較，P<0.05。圖3 Ndfip2對(duì)肝癌細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響Fig.3 The effect of Ndfip2 on the migration and invasion of HCC cells

2.4 沉默Ndfip2對(duì)肝癌細(xì)胞E-cadherin、Vimentin、N-cadherin蛋白的影響

倒置顯微鏡下觀察NC組、si-Ndfip2組SMMC-7721和HepG2細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與NC組比較，si-Ndfip2組部分SMMC-7721和HepG2細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，由長(zhǎng)梭形或紡錘形轉(zhuǎn)變?yōu)橐?guī)則的鋪路石樣，形態(tài)往上皮樣轉(zhuǎn)化。見圖4A。蛋白印跡法結(jié)果顯示，與NC組比較，si-Ndfip2組SMMC-7721和HepG2細(xì)胞的E-cadherin蛋白表達(dá)顯著上調(diào)；而N-cadherin和vimentin蛋白表達(dá)則顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4B～E。

注：A為倒置顯微鏡觀察肝癌細(xì)胞形態(tài)變化(×400)，B～E為SMMC-7721Western blot結(jié)果圖；(1)與NC組比較，P<0.05。圖4 Ndfip2低表達(dá)后EMT標(biāo)記蛋白表達(dá)情況Fig.4 The expression levels of EMT marker protein after Ndfip2 low expression

3 討論

肝癌是全球最為普遍的惡性腫瘤和主要致死原因之一。盡管在肝癌的治療方法方面取得了一些進(jìn)展，但切除肝癌后的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)率依然很高，這是導(dǎo)致臨床治療失敗和患者死亡的主要原因之一[4-5]，因此探尋并闡明肝癌發(fā)展和轉(zhuǎn)移的機(jī)制對(duì)于肝癌的臨床治療和防治極其重要，這也是人們一直潛心研究的重要課題和努力方向。泛素化是一種翻譯后修飾，影響多種細(xì)胞過程，對(duì)于細(xì)胞體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持至關(guān)重要。在三酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)中，E3泛素連接酶通過募集底物并促進(jìn)或直接催化泛素轉(zhuǎn)移至靶標(biāo)，因而在很大程度上決定了泛素化反應(yīng)的特異性[6]。研究發(fā)現(xiàn)E3泛素連接酶的遺傳改變，異常表達(dá)或功能障礙是人類癌癥發(fā)生和發(fā)展的原因[7]。例如E3泛素連接酶NEDD4家族，研究發(fā)現(xiàn)，NEDD4在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)細(xì)胞系中的過表達(dá)促進(jìn)了NSCLC細(xì)胞生長(zhǎng)，而NEDD4的沉默則顯著抑制了NSCLC細(xì)胞在體內(nèi)和體外的增殖[8]。Ndfip2，全稱Nedd4家族交互作用蛋白2，可與Nedd4家族成員蛋白的 WW 結(jié)構(gòu)域結(jié)合并其家族成員，是E3泛素連接酶Nedd4家族的激活因子，影響蛋白質(zhì)泛素化的進(jìn)程[9]。最新研究發(fā)現(xiàn)其同源蛋白質(zhì)Ndfip1可以通過AKT/mTOR介導(dǎo)的Warburg效應(yīng)促進(jìn)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的轉(zhuǎn)移[10]，然而Ndfip2對(duì)肝癌的作用卻鮮有報(bào)道，因此本課題組通過免疫組化和蛋白印跡法檢測(cè)了肝癌組織和肝癌細(xì)胞SMMC-7721和HepG2中Ndfip2 的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明與癌旁組織和正常肝細(xì)胞LO2相比，肝癌組織和肝癌細(xì)胞SMMC-7721和HepG2中Ndfip2表達(dá)顯著升高。為了進(jìn)一步研究Ndfip2對(duì)肝癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，本實(shí)驗(yàn)通過Ndfip2 si-RNA轉(zhuǎn)染SMMC-7721和HepG2靶向沉默肝癌細(xì)胞中Ndfip2表達(dá)，通過劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)Ndfip2對(duì)肝癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，結(jié)果顯示相對(duì)于NC組，si- Ndfip2組遷移面積和遷移侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著減少，提示沉默Ndfip2顯著抑制肝癌細(xì)胞SMMC-7721和HepG2的遷移和侵襲能力。

EMT是上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)變過程，也是上皮細(xì)胞失去極性并獲得遷移和侵襲能力的過程。大量實(shí)驗(yàn)表明，EMT的生物學(xué)過程被認(rèn)為是致癌作用的關(guān)鍵標(biāo)志，靶向EMT途徑是一種有潛力的癌癥治療策略[11]。EMT的標(biāo)志是上皮標(biāo)志物表達(dá)的喪失，通常由E-鈣黏蛋白(E-cadherin)的存在來表明，而間充質(zhì)標(biāo)志物表達(dá)(如N-cadherin和Vimentin)的增加伴隨著侵襲性表型的改變[12]。本實(shí)驗(yàn)在倒置顯微鏡下觀察NC組和si-Ndfip2組SMMC-7721和HepG2細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，發(fā)現(xiàn)SMMC-7721和HepG2細(xì)胞沉默Ndfip2后，部分肝癌細(xì)胞形態(tài)及體積縮小，呈現(xiàn)上皮樣改變。采用蛋白印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示當(dāng)SMMC-7721和HepG2細(xì)胞中Ndfip2低表達(dá)后，E-cadherin的蛋白表達(dá)顯著上調(diào),而N-cadherin和vimentin的蛋白表達(dá)則顯著下調(diào)，提示沉默Ndfip2可能抑制EMT的發(fā)生。