劉敏， 羅昭遜， 黃健,3， 晏嬌艷， 陸景潤(rùn)， 莫非,3， 張姝,3**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院， 貴州 貴陽(yáng) 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 兒科學(xué)院， 貴州 貴陽(yáng) 550004； 3.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 臨床檢驗(yàn)中心， 貴州 貴陽(yáng) 550004； 4.貴陽(yáng)市第一人民醫(yī)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科， 貴州 貴陽(yáng) 550004)

乳腺癌是發(fā)生在乳腺上皮組織的最常見的惡性腫瘤，2020年已有230萬(wàn)新發(fā)BC病例，占所有癌癥的11.7%[1]。隨著手術(shù)、放化療、內(nèi)分泌治療等治療策略的不斷完善及多模態(tài)成像設(shè)備的應(yīng)用，BC的治療療效得到了極大的改善[2-4]，但每年仍有約68萬(wàn)人死于BC。BC的發(fā)生發(fā)展被認(rèn)為是一個(gè)多因素、多階段、多基因改變協(xié)同調(diào)控的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[5]。因此，進(jìn)一步深入研究BC的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，尋找新干預(yù)靶點(diǎn)，對(duì)提高BC患者的生存質(zhì)量具有重要的研究意義。Casitas B系淋巴瘤原癌基因(casitas b-lineage lymphoma,CBL)，又稱c-CBL或CBL2，位于人類染色體11q23.3上，是一種泛素E3連接酶，負(fù)責(zé)在不同類型的細(xì)胞中針對(duì)不同類型的刺激進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[6-8]。研究表明受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTK)與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的惡性進(jìn)展呈正相關(guān)[9-10]，CBL可導(dǎo)致RTK的泛素化，致使其降解[11-12]，抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展[13-14]。因此CBL可能在人類癌癥的發(fā)病機(jī)制中起抑癌作用。陸景潤(rùn)等[15]的研究發(fā)現(xiàn)CBL在BC組織中表達(dá)下調(diào)，但對(duì)其作用機(jī)制未作深入了解。為進(jìn)一步探究CBL在BC中的作用機(jī)制，本研究檢測(cè)了BC組織中CBL的表達(dá)水平，并進(jìn)一步利用生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)與其有相互作用的微核糖核酸(microRNA，miRNA)，旨在探討CBL在BC癌變進(jìn)程中發(fā)揮的作用及其對(duì)應(yīng)的上游調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1樣本收集 收集2015年1月—2018年12月乳腺外科的30對(duì)BC組織及癌旁組織(距腫瘤邊緣2～5 cm)，均為女性，36～69歲、平均55.5歲，所有患者均經(jīng)病理學(xué)分析證實(shí)為BC，且為初次診斷。

1.1.2主要試劑 TRIzol試劑及引物合成(上海生工生物工程有限公司)，逆轉(zhuǎn)錄Kit及實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑[寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司]，RIPA裂解液、BCA試劑盒及蛋白Marker(北京索萊寶科技有限公司)，兔抗人CBL抗體(abcam公司)，兔抗人GAPDH一抗(沈陽(yáng)萬(wàn)類生物科技有限公司),羊抗兔二抗(Proteintech公司)。

1.1.3主要儀器 普通PCR儀(美國(guó)Thermo Scientific公司)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Roche)，Western blot電泳儀、轉(zhuǎn)印系統(tǒng)、曝光儀[伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司]。

1.2 方法

1.2.1逆轉(zhuǎn)錄-實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative and reverse transcription polymerase chain reaction, qRT-PCR)驗(yàn)證CBL基因及hsa-let-7e-5p的表達(dá) 在BC組織和癌旁組織中檢測(cè)CBL和hsa-let-7e-5p的表達(dá)情況：TRIzol法提取BC組織及癌旁組織總RNA，總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后用于qRT-PCR，所用的引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.2.2Western blot驗(yàn)證CBL蛋白的表達(dá) 在BC組織和癌旁組織中檢測(cè)CBL蛋白的表達(dá)情況：RIPA裂解BC組織及癌旁組織并提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度；使用SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳，200 mA恒定電流轉(zhuǎn)膜2 h，5%脫脂牛奶封閉2 h，使用相應(yīng)的一抗在4 ℃條件下孵育過夜，TBST洗膜3次后，將二抗于室溫下孵育1 h，孵育完成后TBST洗膜3次進(jìn)行曝光。

1.2.3CBL基因的生存分析 Kaplan-Meier Plotter(http://kmplot.com/analysis/)[16]數(shù)據(jù)庫(kù)是一個(gè)與惡性腫瘤預(yù)后相關(guān)的在線分析數(shù)據(jù)庫(kù)，可以評(píng)估54 000多個(gè)基因在21種癌癥類型中對(duì)于患者預(yù)后的影響。以KaplanMeierPlotter數(shù)據(jù)庫(kù)為基礎(chǔ)，評(píng)價(jià)CBL基因在BC患者中的預(yù)后價(jià)值，并繪制了KaplanMeier生存曲線。

1.2.4TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)分析CBL與多種免疫細(xì)胞的相關(guān)性 腫瘤免疫評(píng)估資源數(shù)據(jù)庫(kù)(tumor immune estimation resource, TIMER)可全面研究腫瘤與免疫相互作用的分子特征[17]。使用該數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)CBL與BC中6種免疫細(xì)胞的相關(guān)性進(jìn)行分析，包含B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞。檢索條件如下：(1)Gene Symbol，CBL；(2)Cancer Types，BRCA。

1.2.5靶向CBLmiRNAs的預(yù)測(cè) 通過TarBase(http://carolina.imis.athena-innovation.gr/diana_tools/web/index.php?r=tarbasev8/index)和miRWalk(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)[18]數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)與CBL相關(guān)的miRNAs，將結(jié)果分別上傳到Venn在線工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)中，將兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的預(yù)測(cè)結(jié)果取交集后，獲得重疊的miRNAs。

1.2.6CBL與靶向CBLmiRNA結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè) 將CBL3′非翻譯區(qū)(untranslated Regions, UTR)的序列與hsa-let-7e-5p的序列輸入RNAhybrid 2.2[19]軟件，依據(jù)該網(wǎng)站的運(yùn)算規(guī)則，對(duì)結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，選取最小配對(duì)自由能對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)作為CBL3′ UTR與hsa-let-7e-5p的結(jié)合位點(diǎn)。

1.2.7生物信息學(xué)工具分析miRNAs的表達(dá)情況 UCSC Xena網(wǎng)站[20](https://xenabrowser.net/datapages/)集合了包括TCGA、CCLE等在內(nèi)的200多個(gè)數(shù)據(jù)集，利用該網(wǎng)站從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)下載756例BC組織樣本和76例正常乳腺組織中預(yù)測(cè)的5種miRNAs的表達(dá)譜，并對(duì)其表達(dá)進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 CBL在BC組織中的表達(dá)

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與癌旁組織比較，BC組織中CBL表達(dá)下調(diào)(P<0.05)。見圖1A。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與癌旁組織比較，BC組織中CBL蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05)。見圖1B。與qRT-PCR結(jié)果趨勢(shì)一致。

注：A為qRT-PCR結(jié)果，B為Western blot結(jié)果；(1)與癌旁組比較，P<0.05。圖1 qRT-PCR及Western blot檢測(cè)CBL在BC組織中的表達(dá)Fig.1 Detection of CBL expression in BC by qRT-PCR and Western blot

2.2 BC患者腫瘤組織中CBL的表達(dá)與臨床資料的關(guān)系

CBL的表達(dá)水平與患者的轉(zhuǎn)移情況顯著相關(guān)(P<0.05)，而與BC患者的pTNM分期、分子分型及年齡無(wú)關(guān)。見表2。

表2 CBL的表達(dá)與BC患者臨床資料的關(guān)系[n(%)]Tab.2 Correlation between the expression of CBL and the clinical data of patients with BC[n(%)]

2.3 CBL高表達(dá)與BC患者的預(yù)后的相關(guān)性

CBL與BC患者的總生存期(overall survival,OS)有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，高表達(dá)CBL的BC患者OS較短，預(yù)后較差。見圖2。

圖2 CBL與BC患者的預(yù)后相關(guān)性Fig.2 Correlation of CBL and the prognosis of BC patients

2.4 CBL的表達(dá)與BC的腫瘤純度和免疫浸潤(rùn)水平相關(guān)性

CBL的表達(dá)與腫瘤的純度呈負(fù)相關(guān)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=-0.118，P<0.05)；與B細(xì)胞(r=0.183，P<0.05)、CD8+T細(xì)胞(r=0.392，P<0.05)、CD4+T細(xì)胞(r=0.329，P<0.05)、巨噬細(xì)胞(r=0.34，P<0.05)、中性粒細(xì)胞(r=0.404，P<0.05)和樹突狀細(xì)胞(r=0.333，P<0.05)呈正相關(guān)性。見圖3。

注：Purity為腫瘤純度，B Cell為B細(xì)胞，CD8+ T Cell為CD8+ T細(xì)胞，CD4+ T Cell為CD4+ T細(xì)胞，Macrophage為巨噬細(xì)胞，Neutrohil為中性粒細(xì)胞，Dendritic Cell為樹突狀細(xì)胞。圖3 BC中CBL的表達(dá)與腫瘤純度和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平的相關(guān)性Fig.3 Correlation of CBL expression in BC with tumor purity and immune cell infiltration level

2.5 靶向CBL miRNA的預(yù)測(cè)

為進(jìn)一步探索CBL的作用機(jī)制，本研究利用TarBase和miRWalk數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)與CBL相關(guān)的miRNAs，分別有20個(gè)和958個(gè)；利用Venn在線工具將兩者取交集共獲得5個(gè)miRNAs，分別為hsa-miR-7-5p、hsa-miR-28-5p、hsa-miR-378a-3p、hsa-miR-876-3p及hsa-let-7e-5p。見圖4。

注：深色為TarBase預(yù)測(cè)的作用于CBL miRNAs，淺色為miRWalk預(yù)測(cè)的作用于CBL miRNAs。圖4 韋恩圖獲取預(yù)測(cè)的miRNAs的交集Fig.4 Venn diagram to obtain the intersection of predicted miRNAs

2.6 hsa-let-7e-5p與CBL結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)

通過RNAhybrid 2.2軟件對(duì)CBL3′UTR的序列與hsa-let-7e-5p的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)在CBL的3′ UTR的第5017個(gè)核苷酸處存在結(jié)合位點(diǎn)，表明hsa-let-7e-5p可能通過與CBL結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)功能。見圖5。

圖5 預(yù)測(cè)的CBL 3′UTR與hsa-let-7e-5p的結(jié)合位點(diǎn)Fig.5 Predicted binding site of CBL 3′UTR and hsa-let-7e-5p

2.7 靶向CBL miRNAs在BC組織中的表達(dá)

為進(jìn)一步驗(yàn)證與靶向CBLmiRNAs，本研究從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)下載并分析5個(gè)miRNAs在BC組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示hsa-miR-28-5p、hsa-miR-378a-3p和hsa-miR-876-3p在BC組織中低表達(dá)，而hsa-let-7e-5p和hsa-miR-7-5p在BC組織中高表達(dá)(P<0.05)。見圖6A。結(jié)合miRNA-mRNA的負(fù)調(diào)控機(jī)制以及文獻(xiàn)檢索[21]，本研究將hsa-let-7e-5p作為后續(xù)研究對(duì)象，利用qRT-PCR對(duì)30例BC組織及相應(yīng)的癌旁組織進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)hsa-let-7e-5p在BC組織中高表達(dá)(P<0.05)。見圖6B。這一結(jié)果與生物信息學(xué)所得趨勢(shì)一致。

注：A為TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中5種miRNAs的表達(dá)，B為hsa-let-7e-5p在BC組織中的qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果；(1)與正常組比較，P<0.05；(2)與癌旁組織比較，P<0.05。圖6 miRNAs在正常組織或癌旁組織及BC組織中的表達(dá)Fig.6 The expression of miRNAs in normal tissues or adjacent tissues and BC tissues

3 討論

BC是女性最為常見的惡性腫瘤之一，且發(fā)病率和病死率逐年增長(zhǎng)[22]，成為威脅女性健康的“頭號(hào)殺手”。由于BC發(fā)病早期缺乏典型性和特異性臨床癥狀及體征，多數(shù)患者確診時(shí)已有淋巴結(jié)、骨及腦等遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的中晚期體征，嚴(yán)重威脅女性的身心健康，成為女性癌癥死亡的最大原因。因此，尋找干預(yù)BC發(fā)生發(fā)展的靶標(biāo)已成為當(dāng)代學(xué)者研究的熱點(diǎn)。CBL是一種蛋白質(zhì)編碼基因，可編碼含有RING (really interesting new gene)指結(jié)構(gòu)域的E3泛素-蛋白質(zhì)連接酶。編碼的CBL蛋白可介導(dǎo)泛素從E2泛素結(jié)合酶轉(zhuǎn)移至特定底物。此外還包含一個(gè)N末端磷酸酪氨酸激酶結(jié)合域，該結(jié)構(gòu)域可使其與眾多酪氨酸磷酸化的底物相互作用，并使得蛋白酶體降解。因此，CBL可充當(dāng)許多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的負(fù)調(diào)節(jié)劑。研究表明，CBL在胰腺導(dǎo)管腺癌[23]、非小細(xì)胞肺癌[11]及結(jié)直腸癌[12]的發(fā)生、發(fā)展、治療及預(yù)后中發(fā)揮重要作用。Jing等[24]在神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者樣本中通過免疫組織化學(xué)、Western blot和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)，繪制KaplanMeier生存曲線，并進(jìn)行Cox回歸分析表明膠質(zhì)瘤中c-Cbl高表達(dá)與腫瘤進(jìn)展和不良預(yù)后有關(guān)。Yu等[12]發(fā)現(xiàn)miRNA-155可靶向作用于CBL調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期、凋亡和遷移。以上研究說(shuō)明CBL與癌癥的發(fā)生發(fā)展存在密切的關(guān)系。為進(jìn)一步探究CBL在BC中的作用，本研究利用qRT-PCR和Western blot從mRNA和蛋白層面檢測(cè)了BC組織中CBL的表達(dá)，兩者結(jié)果均顯示BC組織中CBL表達(dá)下調(diào)。KaplanMeier分析顯示CBL低表達(dá)，患者預(yù)后好。對(duì)BC患者臨床病理資料與CBL相對(duì)表達(dá)量相關(guān)性分析顯示，CBL與轉(zhuǎn)移情況有關(guān)。本研究表明BC組織中可見大量免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，參與BC的發(fā)生發(fā)展[25]。不僅如此，CBL的表達(dá)與腫瘤的純度呈負(fù)相關(guān)性，與B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞呈正相關(guān)性，提示CBL與BC的免疫浸潤(rùn)相關(guān)，可能通過與免疫細(xì)胞相互作用而影響B(tài)C的進(jìn)展，但具體的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。

miRNA是一類長(zhǎng)度約20～22個(gè)寡核苷酸的短小單鏈非編碼RNA。miRNA可通過與其靶基因的mRNA的3′UTR結(jié)合，降解靶基因mRNA或抑制靶基因的翻譯，最終起到調(diào)控靶基因蛋白表達(dá)的作用，在癌癥中間接發(fā)揮抑癌因子或促癌因子的作用[26-27]。生物信息學(xué)分析與qRT-PCR結(jié)果均顯示hsa-let-7e-5p在BC組織中高表達(dá)，這與Oztemur[28]和Silva等[29]的報(bào)道一致。hsa-let-7e-5p在BC組織中高表達(dá)而CBL低表達(dá)，且hsa-let-7e-5p與CBL的3′UTR之間存在結(jié)合位點(diǎn)，以上結(jié)果提示hsa-let-7e-5p可負(fù)調(diào)控CBL。因此，本研究推測(cè)hsa-let-7e-5p通過負(fù)向調(diào)控CBL的表達(dá)，影響B(tài)C的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，CBL可作為BC的潛在生物標(biāo)志物，其低表達(dá)與BC患者的預(yù)后相關(guān)。hsa-let-7e-5p可能通過負(fù)向調(diào)控CBL的表達(dá)來(lái)發(fā)揮生物學(xué)功能，但具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步探索和研究。