何維 安天星 余玲 廖柯 陳超 劉迎濤 胡潔 鄧婷 尹鑫 蘇波 趙志峰

摘要 [目的]從傳統(tǒng)的四川太和毛霉豆豉中分離產(chǎn)蛋白酶較高的優(yōu)勢菌株，并通過形態(tài)學與分子生物學技術進行鑒定，研究菌株酶活。[方法]以四川太和毛霉豆豉為研究對象，通過分離、純化技術分離其中優(yōu)勢菌，并結(jié)合形態(tài)學與分子生物學技術進行特征菌落鑒定，最后對2株霉菌的蛋白酶和纖維素酶活性進行檢測。[結(jié)果]四川太和毛霉豆豉中2 株產(chǎn)蛋白酶較高的優(yōu)勢菌株分別為M-THF-01與M-THF-02;經(jīng)形態(tài)學與分子生物學鑒定技術發(fā)現(xiàn)，M-THF-01為雅致放射毛霉（ Actinomucor elegans） ，M-THF-02為總狀毛霉 （Mucor racemosa） 。M-THF-01與M-THF-02 中性蛋白酶酶活分別為（83.00±4.25） U/mL 和 （277.35±6.09）U/mL，酸性蛋白酶分別為 （156.36±3.68） U/mL和（405.69±4.18） U/mL，堿性蛋白酶分別為（19.30±2.56） U/mL和（25.37±3.88）U/mL，產(chǎn)纖維素總體酶活分別為（2.51±0.85） U/mL 和（3.64±1.31） U/mL。總體來說，M-THF-02產(chǎn)酶活力明顯高于M-THF-01。[結(jié)論]該研究可為毛霉豆豉純復合發(fā)酵劑的研發(fā)提供理論基礎，并為毛霉豆豉的工業(yè)化與規(guī)模化生產(chǎn)提供科學依據(jù)。

關鍵詞 豆豉;分離;鑒定;雅致放射毛霉;總狀毛霉;酶活

中圖分類號 TS 201.3 ?文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2021）14-0157-05

Abstract [Objective]To isolate the dominant strain with high protease production from the traditional Sichuan Taihe Mucor Douchi， and identify the strains by morphology and molecular biology technology and study the enzyme activity of the strains. [Method]In this study， Mucor Taihe Douchi was used as the research object. The dominant bacteria were isolated by separation and purification technology， and the characteristic colonies were identified by morphological and molecular biological techniques. Finally， the protease and cellulase activities of the two strains were detected. [Result]The results showed that M-THF-01 and M-THF-02 were the two dominant protease producing strains in Sichuan Taihe Mucor Douchi， and M-THF-01 was ?Actinomucor elegans ?and THF-02 was ?Mucor racemosus. ?The neutral protease activities of M-THF-01 and M-THF-02 were （83.0±4.25） U/mL and （277.35±6.09） U/mL， respectively;acid protease were （156.36±3.68） U/mL and （405.69±4.18） U/mL;alkaline protease were （19.3±2.56） U/mL and （25.37±3.88） U/mL;the total cellulase activity of M-THF-01 and M-THF-02 were （2.51±0.85）U/mL and （3.64±1.31）U/mL respectively;in general， the enzyme activity of M-THF-02 was significantly higher than that of M-THF-01. This study provides a theoretical basis for the development of Mucor Douchi pure compound starter， and provides the scientific basis for the industrialization and largescale production of Mucor Douchi.

Key words Douchi;Separation;Identification; Actinomucor elegans;Mucor racemosa; Enzyme activity

基金項目 四川省省級財政科技計劃重點研發(fā)項目（2018GZ0022）。

作者簡介 何維（1995—），男，四川遂寧人，碩士研究生，研究方向：食品微生物與發(fā)酵工程。*通信作者，副教授，博士，從事農(nóng)產(chǎn)品及食品深加工研究。

收稿日期 2020-12-08

豆豉起源于我國，古代稱為“幽寂”，豆豉是一種以大豆或黑豆為原料，經(jīng)選雜、浸泡、蒸煮、制曲、拌料、后發(fā)酵等工序制成的傳統(tǒng)發(fā)酵類調(diào)味品，因其具有極高的營養(yǎng)價值、較高的食用、藥用價值以及獨特的風味，而深受大眾喜愛[1-2] 。豆豉獨特的風味形成主要是利用接種的微生物分泌產(chǎn)生的蛋白酶[3] 、糖化酶[4] 、脂肪酶[5] 等來分解大豆蛋白、脂肪、淀粉等大分子物質(zhì)，產(chǎn)生多肽、氨基酸、寡糖、單糖等物質(zhì)，這些風味前體物質(zhì)在后期的發(fā)酵過程中發(fā)生一系列生化反應來豐富味型，或者通過加入一些調(diào)味品來形成具有一定色香味且營養(yǎng)豐富的豆豉。豆豉不僅含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物，還含有多種生物活性物質(zhì)如大豆異黃酮[6] 、大豆多肽[7] 、豆豉纖溶酶[8] 等，對延緩衰老、預防疾病、降血壓及抗氧化活性有一定的積極作用[9-10] 。根據(jù)豆豉產(chǎn)生時參與發(fā)酵微生物種類的不同，可以分為毛霉型豆豉[11] 、曲霉型豆豉[12] 、細菌型豆豉[13] 、根酶型豆豉[14] 四大類，其中以毛霉型豆豉最富有特色。目前，毛霉型豆豉的發(fā)酵沿用傳統(tǒng)的自然發(fā)酵，而傳統(tǒng)自然發(fā)酵豆豉中自然菌株發(fā)酵的能力差異較大[14] 。為了獲得高產(chǎn)蛋白酶的菌株，國內(nèi)外學者在微生物分離方面做了大量研究，如陳怡等[15] 從瀏陽豆豉中分離出3株溜曲霉菌000、5132、621，結(jié)果表明，菌株621蛋白酶活性最強，為（207.98±3.20） U/mL;菌株5132的纖維素酶活性最強，為（3.40±1.40） U/mL;菌株000的脂肪酶活性最高，其酶活為（90.7±0.64） U/mL。鄧維琴等[16] 從郫縣豆瓣醬中篩選出2株高產(chǎn)蛋白酶的菌株PCSM01與PCSM02，在麥麩培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d后，其蛋白酶活分別是1 450.25、1 703.25 U/g;Chancharoonpong等[17] 以米曲（ Aspergillus oryzae） 發(fā)酵含量為60%大豆的曲司并對其酶活進行了研究，結(jié)果表明，48 h時蛋白酶活性達到最高，為84.38 U/g。

筆者從傳統(tǒng)的四川太和毛霉豆豉中分離得到產(chǎn)蛋白酶較高的優(yōu)勢菌株，并通過形態(tài)學與分子生物學技術進行鑒定，分別研究鑒定菌株的中性蛋白酶、酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、纖維素總體酶的酶活，旨在為今后毛霉豆豉純復合發(fā)酵劑的研發(fā)及毛霉豆豉的工業(yè)化與規(guī)模化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 四川太和毛霉豆豉采自成都太和坊釀造有限公司。

1.2 試劑與儀器 主要試劑：蔗糖、氫氧化鈉、無水磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、干酪素、無水碳酸鈉、三氯乙酸、硼砂、乳酸、乳酸鈉等試劑均為分析純，成都鴻盛達科技有限公司;馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、麥麩培養(yǎng)基，成都鴻盛達科技有限公司。

主要儀器：HH-S4 數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇金怡儀器有限公司;C1000 Thermal Cycler PCR儀，美國Bio-Rad公司;SUB-CELL GT水平電泳槽，美國Bio-Rad公司;SW-CG-1G超凈工作臺，蘇州博萊爾凈化設備有限公司;Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司;YXQ-100S11蒸汽滅菌鍋，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;DA2204B電子天平，上海天美天平儀器有限公司;CX40P電子顯微鏡，寧波舜寧儀器有限公司;DHG-9245A電熱恒溫鼓風干燥箱，上海一恒科技有限公司;BCD-218STPS冰箱，青島海爾股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 毛霉分離純化。

將 10 g 豆豉樣品放入三角瓶中，加入90 mL無菌生理鹽水，搖勻制成菌懸浮液，稀釋到 10-6;選取稀釋梯度為 10-3、10-4、10-5 的樣品稀釋液涂布于 PDA 平板，28 ℃培養(yǎng) 48～72 h。挑取生長旺盛的菌落，用平板劃線法接種到 PDA 培養(yǎng)基上;并將培養(yǎng)基放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，待菌落長出較多時，繼續(xù)劃線純化，直至純化出單一菌落。

1.3.2 目標菌株的形態(tài)特征觀察。

利用傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定的方法，對經(jīng)過復篩分離、純化得到的菌株進行觀察。通過電子顯微鏡觀察菌落的形態(tài)特征、孢子囊及孢子生長速度等，初步確定菌種類型。

1.3.3 目標菌株的分子生物學鑒定。

1.3.3.1 DNA 的提取。將懸浮在純化水中的真菌細胞50～100 mg（WW）加入裂解管中，再向裂解管中加入750 μL裂解液，再加入500 μL裂解液和150 μL KAC，50 μL異丙醇反復離心15 min;收集上清液，加入等體積的70%乙醇，離心10 min 后待水分散失后加入0.1×TE30 μL，收集上清液，提取目標菌株的DNA。

1.3.3.2 PCR 的擴增。

18Sr DNA 序列分析：使用真菌18Sr DNA 的通用引物進行 PCR 擴增，引物的序列如下：ITS1（5-TCCGTAGGTGAACCTGCGGAGTT3） ? ITS4（5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3）;PCR 的反應體系25 μL，包括

DNA（20 ng/μL）2.0 μL，F(xiàn)orward Primer （100 μmol/L） 2.5 μL，Reverse Primer （10 μmol/L） 2.5 μL，H2O 18 μL，擴增反應條件為預變性：95 ?℃ 5 min，變性：94 ?℃ 45 s，復性：55 ?℃ 45 s，延伸：72 ?℃ 45 s 30 個循環(huán)，補充循環(huán)：72 ℃ 1 min。擴增產(chǎn)物經(jīng) 1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，再將其產(chǎn)物送交成都羅寧生物有限公司進行測序。利用 NCBI中 BLAST 分析工具將所分離菌株的測序結(jié)果在 GenBank 數(shù)據(jù)庫中進行比對。

1.3.4 菌株酶活測定。

1.3.4.1 待測酶液的制備。

將純化的雅致放射毛霉與總狀毛霉接種到大豆中，培養(yǎng)48 h后，稱取長滿毛霉的豆粒（不碾碎）10 g，加水至100 mL，在40 ℃水浴中間斷攪拌1 h，過濾，濾液分別用pH 7.2磷酸緩沖液、pH 2.5乳酸-乳酸鈉緩沖液、pH 10硼砂-氫氧化鈉緩沖液稀釋到一定倍數(shù)，待測。

1.3.4.2 蛋白酶活的測定。

參照SB/T 10317—1999[18] 的方法測定：空白試管組和酶樣試管組，在不同接種條件下，分別加入1 mL粗酶液，在40 ℃水浴中預熱2 min，加入0.4 mol三氯乙酸2 mL，加入1 mL酪蛋白溶液，加入2 mL三氯乙酸加入試管組（酶樣），10 min后過濾。取濾液1 mL，加入0.4 mol碳酸氫鈉5 mL，福爾林試劑1 mL，40 ℃顯色20 min，紫外分光光度計在680 nm處測定吸光度。

將在40 ℃下1 min水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸，定義為1個蛋白酶活力單位。

樣品蛋白酶活力單位（干基）= A10×4×N×11-W

式中，A 為由樣品測得OD值× K ，4為4 mL反應液取出1 mL測定（即4倍），

N 為酶液稀釋倍數(shù)，10為反應10 min， W 為樣品水分百分量。

1.3.4.3 纖維素總體酶活的測定（FPA活力單位的測定）。參照文獻[19]中的方法測定。1 mL酶液在 50 ℃pH為4.8的條件下，每1 min水解1 cm×6 cm 的濾紙產(chǎn)生1 μg還原糖，以葡萄糖計的酶量定義為1個纖維素總體酶活力單位。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株形態(tài)特征分析 將菌株M-THF-01、M-THF-02活化后，采用點值法在 PDA 瓊脂平板上接種，于28 ℃培養(yǎng)48 h 后，觀察其菌落形態(tài)，結(jié)果見圖 1、2。由圖1可知，菌株M-THF-01菌落直徑約35 mm，初期顏色為白色，中后期為淺橙黃色;通過顯微鏡觀察到菌株 M-THF-01孢囊梗直立分枝多集中于頂端，孢子囊成球形，有不發(fā)達的假根。從圖2可知，菌株 M-THF-02 菌落直徑約 50 mm，初期顏色為白色，中后期變?yōu)楹只疑z生長有褐色孢子;通過顯微鏡觀察到菌株 M-THF-02 頂端孢子囊為橢球型，孢囊梗與囊軸連接，接連處無囊托、無假根。

2.2 目標菌株的分子生物學鑒定

以菌株M-THF-01、M-THF-02基因組為模板，利用真菌通用引物PCR擴增其18Sr DNA 序列，PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳驗證，電泳結(jié)果如圖3所示，發(fā)現(xiàn)僅有1條單一目標條帶，條帶為 629～648 bp，與預期長度一致。

將 PCR 擴增產(chǎn)物送交成都羅寧生物有限公司進行序列測定，獲得的 PCR 產(chǎn)物測序結(jié)果與 Genback 中的 18Sr DNA 序列進行比對，結(jié)果如圖4、5所示。根據(jù) Genback 中的 18Sr DNA 序列進行比對顯示，M-THF-01 18Sr DNA 序列與雅致放射毛霉 （ Actinomucor elegans ?MN626448.1）同源性達到 100%，再結(jié)合形態(tài)學特征，確定菌株 M-THF-01 為雅致放射毛霉 （Actinomucor elegans）， 并將其保存在武漢的中國典型培養(yǎng)物保藏中心（保藏號： CCTCC M -THF 01 No.2020493）。M-THF-02 18Sr DNA 序列與總狀毛霉 （Mucor racemosus ?HM641690 ）同源性達到 99%，再結(jié)合形態(tài)學特征，確定菌株M-THF-02 為總狀毛霉 （Mucor racemosus）， 并將其保存在武漢的中國典型培養(yǎng)物保藏中心（保藏號： CCTCC M -THF 02 No.2020552）。

2.3 菌株的酶活比較 標準曲線見圖6，根據(jù)標準曲線可以得出線性回歸方程 y=0.500 2x-0.001 0，R2=0.999 6 。

由表1可知，雅致放射毛霉與總狀毛霉的酸性蛋白酶的酶活分別為（83.00±4.25） U/mL和 （277.35±6.09） U/mL;雅致放射毛霉與總狀毛霉的中性蛋白酶的酶活分別為（156.36±3.68） U/mL和（405.69±4.18） U/mL;堿性蛋白酶的酶活分別為（19.30±2.56） U/mL和（25.37±3.88） U/mL。其中酸性蛋白酶與中性蛋白酶的酶活在雅致放射毛霉與總狀毛霉豆豉曲樣中較高，而堿性蛋白酶的活力較弱，這說明毛霉在豆豉的制曲過程中主要是以酸性蛋白酶與中性蛋白酶起著重要作用，這與房翠蘭[20] 的結(jié)果基本一致。Fu等[21] 研究發(fā)現(xiàn)，雅致放射毛霉所產(chǎn)生的酸性蛋白酶與中性蛋白酶對豆豉脫苦的效果較為明顯。潘進權(quán)[22] 研究發(fā)現(xiàn)，毛霉純化所產(chǎn)生的氨肽酶在酸性條件下催化活性最大，且脫苦效果最為明顯。這些研究表明，酸性蛋白酶和中性蛋白酶在后發(fā)酵過程中對苦味的脫出起著重要作用。

毛霉豆豉發(fā)酵過程中纖維素活性的高低決定了大豆中纖維素分解程度的高低，大豆纖維素的降解會對豆豉的硬度、咀嚼、質(zhì)構(gòu)有一定影響。由表1可知，M-THE-01、M-THF-02的纖維素酶活分別是（2.51±0.85）、（3.64±1.31） U/mL，陳怡等[15] 研究發(fā)現(xiàn)，在瀏陽豆豉分離得到的纖維素活力最高，達（3.40±1.40） U/mL。

3 結(jié)論

該研究以四川太和毛霉豆豉為研究對象，分離出2株優(yōu)勢霉菌，對其進行菌落形態(tài)觀察與ITSrDNA基因序列分析，基因序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫利用BLAST工具進行序列對比，結(jié)果表明，菌株M-THF-01為雅致放射毛霉，菌株M-THF-02為總狀毛霉。2株菌株具有不同的產(chǎn)酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、纖維素酶?？傮w來說，M-THF-02產(chǎn)酶活力明顯高于M-THF-01。該研究篩選的總狀毛霉與雅致放射毛霉具有較高的產(chǎn)蛋白酶能力，這為解決單一菌株蛋白酶活力較低，發(fā)酵時間長，復合發(fā)酵劑優(yōu)良菌種選育資源單一等問題提供了理論支撐，并為毛霉豆豉發(fā)酵最終能夠脫離地域環(huán)境限制，實現(xiàn)規(guī)?；?、工業(yè)化發(fā)展提供可能。

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