惠潔，張存莉

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)，陜西楊凌 712100；2.延安職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西延安 716000；3.陜西五丁生物科技有限公司，陜西漢中 724400）

食用植物酵素是以食品加工的植物為主要原料，添加或不添加輔料，經(jīng)微生物發(fā)酵，制成的一種含有特定生物活性成分可供人類食用的酵素產(chǎn)品［1］。食用植物酵素富含大量短鏈脂肪酸、淀粉酶、超氧化物歧化酶、乳酸、醋酸及少量乙醇等代謝產(chǎn)物和酚類、黃酮類等生物活性成分［2-4］，具有清除自由基、抗氧化、抑菌、解酒護(hù)肝、潤(rùn)腸通便、調(diào)節(jié)免疫、促進(jìn)新陳代謝及凈化血液等生理功能[5-7]。發(fā)酵食物對(duì)健康有益，不僅可以改變?cè)系臓I(yíng)養(yǎng)成分，促進(jìn)生物活性化合物的生物合成，還可以優(yōu)化人體腸道微生物菌群，提高免疫力[8]。

本研究以譚芳等人[9]提出的改善痰濕體質(zhì)的藥膳方組方荷葉方為原料，采用乳酸菌和酵母菌先后發(fā)酵的方式發(fā)酵荷葉方濃縮液，利用膽酸鹽結(jié)合試驗(yàn)對(duì)荷葉方中藥酵素的體外降血脂活性進(jìn)行研究，為荷葉方的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)，為尋找廉價(jià)的藥食同源植物活性物輔助高脂血癥的治療和預(yù)防提供研究思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

荷葉、陳皮、山楂，市售。

1.2 試劑與儀器

葡萄酒高活性干酵母，安琪酵母有限公司；乳酸菌（植物乳桿菌）、醋酸菌，臺(tái)灣亞芯生物科技有限公司；甘氨膽酸鈉、?；悄懰徕c、考來(lái)烯胺，國(guó)藥集團(tuán)。

LDZX-50KBS 型高壓滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；UV-1801 型紫外分光光度計(jì)，日本島津公司；ME204E/02 型精密和分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SW-CJ-2FD 型超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；DHP-9052B 型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；BPG-9056A型精密鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；TG16-W 型微量高速離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 荷葉方中藥酵素的制備

取荷葉、陳皮、山楂，配伍質(zhì)量比例為10 ∶5 ∶5，按適當(dāng)比例加水蒸煮，將活化好的乳酸菌、酵母菌醋酸菌先后接種到待發(fā)酵液中進(jìn)行發(fā)酵。

1.3.2 體外降血脂活性研究

參照錢雅雯等人[10]的測(cè)定方法，先分別繪制甘氨膽酸鹽和?；悄懰猁}的標(biāo)準(zhǔn)曲線。配置甘氨膽酸鈉 標(biāo) 準(zhǔn) 溶 液（0 μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、1.5 μg/mL、2.0 μg/mL、2.5 μg/mL）和牛磺膽酸鈉 標(biāo) 準(zhǔn) 溶 液（0 μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、1.5 μg/mL、2.0 μg/mL、2.5 μg/mL）。取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液2 mL 分別置于不同具塞試管中，精密加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%的硫酸溶液8 mL，混勻，70 ℃水浴加熱20 min，迅速冰浴5 min 后，紫外可見(jiàn)分光光度法于387 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，膽酸鹽含量為橫坐標(biāo)，繪制甘氨膽酸鹽和?；悄懰猁}的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

分別移取3 mL 樣品兩份，考來(lái)烯胺（1 mg/mL）3 mL 兩份于4 個(gè)100 mL 三角瓶中，每個(gè)三角瓶分別加入胃蛋白酶溶液（10 mg/mL）3 mL 和的HCl 溶液（0.01 mol/L）1 mL，在37 ℃的恒溫振蕩器內(nèi)振蕩1 h（模擬胃消化環(huán)境），用NaOH 溶液（0.1 mol/L）調(diào)節(jié)pH 至6.3。隨后，加入胰蛋白酶溶液（10 mg/mL）4 mL，37 ℃下恒溫振蕩器振蕩1 h（模擬腸道環(huán)境），一份樣品三角瓶中加入甘氨膽酸鈉（0.4 mmol/L）4 mL，一份考來(lái)烯胺中加入甘氨膽酸鈉（0.4 mmol/L）4 mL；另一份樣品三角瓶中加入?；悄懰猁}（0.5 mmol/L）4 mL，另一份考來(lái)烯胺溶液中加入?；悄懰猁}（0.5 mmol/L）4 mL。在37 ℃的恒溫振蕩器內(nèi)振蕩1 h，于4 000 r/min 離心20 min，取上清液，用比色法于387 nm 處測(cè)定吸光度值，每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算剩余甘氨膽酸鹽和?；悄懰猁}含量，所加入甘氨膽酸鹽或牛磺膽酸鹽總量減去剩余量所得差值與總量的比值即為結(jié)合率，以百分比表示。計(jì)算公式如式（1）所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘氨膽酸鈉和?；悄懰徕c的標(biāo)準(zhǔn)曲線

如圖1 所示，甘氨膽酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.510 6x+0.033 5（R2=0.999），線性關(guān)系良好；?；悄懰徕c標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.464 4x+0.100 0（R2=0.993），線性關(guān)系良好。

圖1 甘氨膽酸鈉和?；悄懰徕c標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 荷葉方中藥酵素體外降血脂活性分析

荷葉方中藥酵素發(fā)酵前后及考來(lái)烯胺（1 mg/mL）與甘氨膽酸鈉和牛黃膽酸鈉的結(jié)合率如圖2 所示。從圖2 可知，荷葉方發(fā)酵前與甘氨膽酸鈉結(jié)合率為55.08%，發(fā)酵后結(jié)合率達(dá)到63.53%，增加了0.15 倍；考來(lái)烯胺（1 mg/mL）結(jié)合率為45.41%。發(fā)酵前與?；悄懰徕c的結(jié)合率為36.39%，發(fā)酵后結(jié)合率達(dá)到63.51%，結(jié)合率增加了0.75 倍；考來(lái)烯胺（1 mg/mL）結(jié)合率為34.17%。結(jié)合率越高，說(shuō)明其降膽固醇的效果越好，這也證實(shí)了荷葉方中藥酵素具有較好的體外降血脂活性。

圖2 荷葉方中藥酵素發(fā)酵前后及考來(lái)烯胺（1 mg/mL）與膽酸鹽的結(jié)合率

3 結(jié)論

荷葉方經(jīng)微生物發(fā)酵后與甘氨膽酸鈉和?；悄懰徕c的結(jié)合率均得到提高，且高于考來(lái)烯胺（1 mg/mL）與膽酸鹽的結(jié)合率，具有較好的體外降血脂活性。