王泉，馬瑞瑛，楊婷，張亞麗，許苗，撒玉玲，陳清波

（新疆醫(yī)科大學第八附屬醫(yī)院檢驗科，新疆烏魯木齊 830049）

肺炎克雷伯菌是一種常見的院內(nèi)感染致病菌，可引起較嚴重的下呼吸道感染甚至死亡[1-2]，在嬰兒、腫瘤患者等長期使用抗生素的病人或免疫力較差的老年人中發(fā)病率較高。臨床癥狀與其他院內(nèi)感染細菌無明顯差異，難以實現(xiàn)通過臨床癥狀對該菌的精準判斷[3]，目前臨床上針對肺炎克雷伯氏菌的檢測方法主要是以傳統(tǒng)的培養(yǎng)法結(jié)合生理生化鑒定或使用最新的全自動細菌鑒定儀，一般需要2 ～3 d，耗時較長。其操作的便捷性、時效性及靈敏度無法滿足臨床上快速精準診斷的要求[4-5]，因此需要建立一種快速靈敏的檢測方法來實現(xiàn)對該菌的鑒定。

近年來，一系列分子生物學技術也被用來進行肺炎克雷伯菌的檢測，如聚合酶鏈式反應（PCR）、多重PCR 和實時熒光定量PCR 等技術[6-8]。但此類方法需要專業(yè)的技術人員和精密的溫控設備，同時PCR技術中使用的Taq 酶活性易受到待檢樣本中的抑制物影響而降低甚至失活，造成檢測結(jié)果不準確[9]。近年來發(fā)展的恒溫擴增技術（如環(huán)介導等溫擴增技術、聚合酶螺旋反應等）是利用BstDNA 聚合酶的作用實現(xiàn)核酸擴增，受待檢樣本中抑制物影響較小而在臨床微生物檢測中廣泛應用。

聚合酶螺旋反應（PolymeraseSpiralReaction，PSR）技術因其操作簡單，耗時短，具有較高的特異性及靈敏度的優(yōu)勢在病原微生物快速檢測方面發(fā)展迅速，相關學者已成功將PSR 技術應用于食源性致病菌、痰液樣本中結(jié)核分枝桿菌等致病菌的檢測。PSR的原理是利用微生物的特異性核酸序列設計4 條引物（2 條檢測引物，2 條加速引物）識別目標基因5個不同區(qū)域，利用BstDNA 聚合酶的活性及核酸分子在63 ℃處于半解離半平衡狀態(tài)實現(xiàn)恒溫條件下快速擴增DNA 分子。

在精準醫(yī)學高速發(fā)展的今天，肺炎克雷伯菌傳統(tǒng)痰培養(yǎng)檢測法已無法滿足要求。本研究基于肺炎克雷伯菌外膜蛋白一段特異性基因設計PSR 反應引物，對引物進行篩選，并對其菌株特異性和最低檢出限進行評價。于2019 年9—12 月間在新疆醫(yī)科大學第八附屬醫(yī)院（原新疆維吾爾自治區(qū)胸科醫(yī)院）連續(xù)收集270 份疑似呼吸道感染患者的痰液樣本，比較PSR基因檢測及痰培養(yǎng)檢測兩種方法的差異性，評價PSR恒溫檢測在呼吸道肺炎克雷伯菌感染診斷中的應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

試劑：DNA 提取液，廣州迪澳生物科技有限公司；BstDNA 聚 合 酶，New England Biolabs；SYTO 9，寶生物工程（大連）有限公司；肺炎克雷伯氏菌核酸測定試劑盒（熒光PCR法），上海之江生物科技有限公司；血平板、巧克力平板和麥康凱平板，賽默飛公司。

細菌及來源：金黃色葡萄球菌ATCC11987，大腸埃希氏菌CMCC44102，肺炎鏈球菌CMCC31001，銅綠假單胞菌ATCC9027，鮑曼不動桿菌ACCC11038，肺炎克雷伯氏菌ATCC4352，嗜麥芽窄食單胞菌BNCC106909，流感嗜血桿菌CMCC585283，嗜肺軍團菌ATCC33152，結(jié)核分枝桿菌BNCC104756，單核增生李斯特菌ATCC19115，創(chuàng)傷弧菌ATCC27562，腸炎沙門氏菌5186，小腸結(jié)炎耶爾森菌ATCC23715，志賀氏菌Q1030，大腸埃希氏菌O157 ATCC700728，蠟樣芽孢桿菌NCTC7997，阪崎腸桿菌ATCC29004，陰溝腸桿菌BNCC353685，均購自北納生物科技有限公司。

儀器：QuantStudio?6 實時熒光定量PCR 儀，美國ABI；VIEK 2 COMPACT 全自動微生物鑒定系統(tǒng)，法國梅里埃。

1.2 引物設計與合成

對肺炎克雷伯氏菌基因通過Blast 比對獲得特異性片段（KPN_04473，Genebank accession No. CP000647），根據(jù)PSR 反應擴增原理使用PrimerExplorer 進行引物設計[10]，設計結(jié)果如表1 所示。其中F1、B1 為檢測引物，IF 及IB 為加速引物。所有引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成，其中F1，B1 采用HPLC方式純化，IF 及IB 采用PAGE 方式進行純化。

表1 PSR 所用引物序列

1.3 樣本DNA 的制備

對收集的臨床痰液樣本，在痰樣中加入等體積痰液液化劑（含有N-乙酰-L-半胱氨酸1.0%，乳化劑0.25%，EDTA10 mmol/L）后渦旋震蕩混勻，室溫下放置15 min，吸取1 mL 加入帶旋蓋的離心管中，以10 000 g 轉(zhuǎn)速離心5min，棄去上清液。隨后加入100 μL 的DNA 提取液并混合均勻，100℃熱裂解10 min。10 000 g 離心2 min，待冷卻至室溫后將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中備用，其中2 μL 作為核酸擴增的模板。

1.4 PSR 反應體系

PSR 反應體系為25 μL。各組分濃度具體如下：10.0 mmol/L KCl，20.0 mmol/L Tris-HCl，0.1% Triton X-100，0.8 mol/L 甜菜堿，10.0 mmol/L（NH4）2SO4，8.0 mmol/L MgSO4，1.4 mmol/L dNTPs，8 U BstDNA 聚合酶，F(xiàn)1 及B1 各1.2 μmol/L，IF 及IB 各0.8 μmol/L，DNA 模板2 μL，SYTO 9 體積為0.5 μL，雙蒸水補齊至25 μL。

1.5 菌株特異性評價

使用如1.1 描述18 種致病菌對反應體系進行驗證。按照1.3 中描述使用DNA 提取液對目標菌株及其他菌株的DNA 模板進行提取，加入2 μL 的DNA模板至PSR 反應體系中，以雙蒸水進行對照，在熒光定量PCR 儀器上于63 ℃反應60 min。

1.6 最低檢出限分析

將初始濃度為106CFU/mL的肺炎克雷伯菌的菌懸液采用10 倍稀釋法將其濃度依次稀釋至105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL、102CFU/mL 和10 CFU/mL。將上述不同濃度的1 mL 菌液樣本以10 000 g 轉(zhuǎn)速離心5 min，棄上清液。加入100 μL 的DNA 提取液，100 ℃加熱10 min。10 000 g 離心2 min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中備用，取2 μL 上清液用于核酸擴增。在熒光定量PCR 儀器上于63 ℃反應60 min，以確定檢測下限。

1.7 結(jié)果判讀

通過熒光定量PCR儀采集熒光值自動計算Ct值。無Ct值時，判定為陰性；Ct值≤55 判定為陽性；55 ＜Ct值≤60，建議復核樣本，若Ct值≤55 或仍在此區(qū)間，樣本為陽性，否則為陰性。

1.8 臨床樣本的檢測

于2019 年9—12 月新疆醫(yī)科大學第八附屬醫(yī)院（原新疆維吾爾自治區(qū)胸科醫(yī)院）連續(xù)收集270 份疑似呼吸道感染患者的痰液樣本。采用吸痰或深咳法將痰液樣本留取于痰培養(yǎng)瓶內(nèi)。將涂片革蘭氏染色鏡檢合格的痰液（白細胞＞25 個/HP，鱗狀上皮細胞＜10 個/HP 為合格，采集痰液樣本均合格）轉(zhuǎn)接至血瓊脂平板進行培養(yǎng)，隨后使用VIEK 2 COMPACT全自動微生物鑒定系統(tǒng)進行菌種鑒定。以鑒定結(jié)果作為最終判讀標準，與PCR 方法進行對比驗證，以評估該方法的臨床適用性及差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選結(jié)果

使用上述PSR 體系及引物濃度進行核酸擴增反應，第1、2、3 和4 套測定的Ct值分別為19.5、15.3、26.2 和49.6，4 套引物中第2 套引物相對于其他引物Ct 值小，說明此引物擴增效率較高，適用于后續(xù)實驗。

2.2 菌株特異性與最低檢出限實驗

基于PSR 反應原理構建的恒溫體系擴增肺炎克雷伯菌梯度濃度模板時，在濃度為10 CFU/mL 時無Ct值，檢測結(jié)果為陰性；濃度為102CFU/mL 時，Ct值為30，檢測結(jié)果為陽性，說明該反應體系最低檢測濃度為102CFU/mL。使用肺炎克雷伯菌及非目標菌株的DNA 模板進行擴增，18 種特異性菌株均為陰性，且陰性對照無非特異性擴增。綜上所述，所篩選出第2 套引物具有較佳的菌株特異性，最低檢出限為102CFU/mL。

2.3 臨床樣本效果評價

從痰培養(yǎng)肺炎克雷伯陽性的54 份痰液DNA 模板樣本中，PSR 體系檢出52 份陽性，2 份陰性。其中2 份培養(yǎng)陽性而PCR 檢測為陰性可能是由于痰樣本中菌量分布不均，未達到反應體系的最低檢出限，導致其檢測結(jié)果為陰性。從痰培養(yǎng)檢測結(jié)果為陰性的216 份樣本中，PSR 檢出16 份陽性，200 份陰性。將這16 份樣本經(jīng)高保真擴增測序比對后均為肺炎克雷伯菌，說明PSR 相對于傳統(tǒng)培養(yǎng)法有更高的敏感度。以痰培養(yǎng)法作為標準，其敏感度為96.30%，特異度為92.59%，陽性預測值為76.47%，陰性預測值為99.01%，總符合率為93.35%（252/270），結(jié)果詳見表2。

表2 以痰培養(yǎng)結(jié)果為參照評價PSR 檢測的效能表

同商業(yè)化熒光定量PCR 試劑盒相比較，PSR 檢測的敏感度及特異度分別為100%和96.63%，且兩者一致性較高（Kappa=0.929 5），表明所使用的反應體系具有和熒光定量PCR 方法相似的檢測效能，見表3。

表3 以熒光定量PCR 試劑盒結(jié)果為參照評價PSR 檢測的效能表

3 討論

據(jù)2013 年世界衛(wèi)生組織報道，由肺炎克雷伯菌引起的腹瀉是導致全球兒童死亡率居高不下的主要原因。同時，肺炎克雷伯菌的感染率占院內(nèi)細菌性感染的9.03%，而臨床上普遍采用的痰培養(yǎng)法耗時長，可能對患者的病情造成延誤。

聚合酶螺旋反應已實現(xiàn)對白色念珠菌和結(jié)核分枝桿菌的檢測。相關學者基于rcsA 基因設計PSR引物檢測肺炎克雷伯菌，細菌基因組最低檢出限為11.5 pg/μL（遠高于培養(yǎng)法的檢測限）[11]，可能會造成大量的漏檢，無法幫助醫(yī)生對病因進行準確判斷而延誤治療，不符合現(xiàn)階段精準醫(yī)學診斷的要求。也有學者利用環(huán)介導等溫擴增技術對肺炎克雷伯菌進行檢測，最低檢出限為103～104CFU/mL，同樣高于培養(yǎng)法最低檢出限。造成上述情況的主要原因可能是所選用的靶標基因為單拷貝基因或引物擴增效率較低。本研究所選用的靶標基為其特異性較高外膜蛋白基因，屬于多拷貝基因。通過篩選的最優(yōu)引物，最低檢出限可達到102CFU/mL，優(yōu)于目前大多數(shù)學者所構建的核酸恒溫擴增體系，為提高臨床肺炎克雷伯氏菌篩查的陽性檢出率提供了可能。

4 結(jié)論

本研究對270 份疑似呼吸道感染患者的痰液樣本，同時進行培養(yǎng)鑒定、PCR 檢測及實時熒光定量PCR 檢測。與痰培養(yǎng)法相比，PSR 檢測肺炎克雷伯菌感染的敏感度和特異度分別為96.30%及92.59%，具有較高的敏感度及特異度；該方法與傳統(tǒng)痰培養(yǎng)法的Kappa 一致性系數(shù)為0.810，顯示出較高的檢測性能；陽性預測值及陰性預測值可分別達到97.1%（68/70）和99.01%（200/202），表明PSR 檢測結(jié)果為陽性者肺炎克雷伯菌感染的概率極高，檢測結(jié)果為陰性者感染肺炎克雷伯菌概率極低，故PSR 適合于臨床樣本肺炎克雷伯氏菌初篩。同商業(yè)化熒光定量PCR 試劑盒檢測結(jié)果相比較，PSR 仍可從熒光定量PCR 檢測結(jié)果陰性樣本篩查出部分陽性結(jié)果，說明該方法比所使用商業(yè)化試劑盒具有更高靈敏度。

本研究所使用的PSR 檢測體系從上樣到報告結(jié)果耗時小于1 h，且不需要精密的溫控設備，適合現(xiàn)場和偏遠地區(qū)基層單位的推廣應用，為臨床醫(yī)生對呼吸道疾病診斷提供快速有效的科學依據(jù)。但隨著廣譜抗菌素的廣泛使用，肺炎克雷伯菌對常用藥物包括第三代頭孢菌素和氨基糖苷類呈現(xiàn)出多重耐藥性，本方法無法確定所篩查細菌是否具有耐藥性，只能做定性分析。面臨如此嚴峻的形勢，一種快捷精準的診斷方法對相關病癥的用藥治療意義重大，期待在未來能夠開發(fā)基于PSR 技術的肺炎克雷伯菌耐藥篩查核酸檢測試劑盒。