簡龍海， 王 柯， 季 申

(上海市食品藥品檢驗所，上海 201203)

痰熱清注射液處方由黃芩、熊膽粉、山羊角、金銀花、連翹五味中藥組成，成分復雜，其中與熊膽粉有關的化學成分分析僅見熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸的定量測定報道[1-3]。作者于近期測定了痰熱清注射液中熊膽粉部分的指紋圖譜[3]，結果指紋圖譜中除含熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸外，尚含2個響應相對較高的未知物。經(jīng)進一步研究發(fā)現(xiàn)，該2個未知物可能為熊去氧膽酸或鵝去氧膽酸的氧化物。為確證其化學結構，作者對熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸進行了氧化，以液相色譜-離子阱質(zhì)譜法(LC-MSn)確證氧化產(chǎn)物，以氧化產(chǎn)物作為對照物進行鑒別。為探索痰熱清注射液熊膽粉部分的物質(zhì)基礎，作者以現(xiàn)有對照品對其他可能含有的膽汁酸進行了鑒別；采用HPLC法對中間體熊膽粉提取物進行了成分定量測定；并測定了熊膽粉提取物的干燥失重。研究結果可為痰熱清注射液及熊膽粉提取物的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 1200型高效液相色譜儀-6330型離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Agilent公司)，1100型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)。

1.2 試藥 熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸、牛磺熊去氧膽酸、?；蛆Z去氧膽酸、膽酸、去氧膽酸、牛磺膽酸鈉對照品均由中國食品藥品檢定研究院提供，批號分別為 0755-9003、110806-200303、816-200004、846-9702、1078-0013、724-9305、815-9702。氯鉻酸吡啶(PCC)試劑由上海晶純試劑有限公司提供，批號20628。乙腈、甲醇、甲酸、冰醋酸均為色譜純，水為Millipore純化水。痰熱清注射液(批號100124)，熊膽粉提取物(批號090704、090705、090706、090707、090801、090803、090804、090806、090807、090902、090903、090905、091001、091004)均由上海凱寶藥業(yè)有限公司提供。

2 方法

2.1 指紋圖譜[3]中2個未知物(分別以Ⅰ、Ⅱ表示)的結構研究色譜條件 Agilent SB C18色譜柱(2.1 mm×15 mm，3.5 μm)；流動相為乙腈-0.05%甲酸(45∶55)；體積流量 0.3 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量1 μL。

2.2 鑒別其他膽汁酸的色譜條件 Waters Atlantis C18色譜柱(4.6 mm × 150 mm，5 μm)；流動相由乙腈(A)和0.01%甲酸(B)組成，梯度洗脫(0 ～ 40 min，20% →50%A；40 ～ 80 min，50%A)；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量1 μL。

2.3 質(zhì)譜條件 電噴霧離子化源(ESI源)；干燥氣溫度 350 ℃，干燥氣體積流量10 L/min；霧化氣 35 psi (1psi=6.895 kPa)；源噴射電壓 3.5 kV；正、負離子模式；二級電壓(MS/MS Frag Ampl)1.0 V；掃描范圍m/z50～1 500。

2.4 對照品溶液的制備 分別取熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸、?；切苋パ跄懰?、?；蛆Z去氧膽酸、膽酸、去氧膽酸、牛磺膽酸鈉對照品各10 mg，精密稱定，分別置10 mL量瓶中，加甲醇使溶解并定容至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為1 mg/mL的貯備液。分別精密吸取各貯備液1 mL，置50 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為20 μg/mL的溶液。精密吸取20 μg/mL的溶液250 μL，置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，得500 ng/mL的溶液，供LC-MSn測定。

2.5 未知物Ⅰ、Ⅱ?qū)φ杖芤旱闹苽?經(jīng)研究，未知物Ⅰ、Ⅱ的相對分子質(zhì)量為390.3，但無法獲得相應對照品。由于熊去氧膽酸(或鵝去氧膽酸)單羥基氧化物的相對分子質(zhì)量亦為390.3，故推測未知物Ⅰ、Ⅱ為熊去氧膽酸(或鵝去氧膽酸)的氧化物。相應對照品通過PCC氧化反應進行半合成。PCC試劑是一種溫和、高效的氧化劑，可將膽汁酸中的仲醇選擇性地氧化為酮而不會進一步氧化為羧酸[5-7]。合成后溶液通過LC-MSn進行分離分析。具體合成方法為：精密稱取8 mg(約0.02 mol)熊去氧膽酸對照品，精密加入8.8 mg (約 0.04 mol) PCC試劑，加10 mL冰醋酸，振搖使溶解，靜置2 h，精密吸取50 μL，置1 mL量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，供LC-MSn測定。精密稱取8 mg(約0.02 mol)鵝去氧膽酸對照品，同法操作。

2.6 供試品溶液的制備 取熊膽粉提取物0.15 g，精密稱定，置10 mL量瓶中，加甲醇振搖使溶解，用甲醇定容至刻度，搖勻，作為供試品溶液A，供LC-MSn分析和HPLC測定。取痰熱清注射液，作為供試品溶液B，供LC-MSn分析。

2.7 熊膽粉提取物中熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸的測定 按照文獻[3]方法進行測定。

2.8 干燥失重測定 按照文獻[4]中的烘箱干燥法進行測定。

3 結果

3.1 對照譜庫的建立 熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸為立體異構體(見圖1)，其兩個羥基均可被PCC試劑氧化成酮[5-8]，故熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸的氧化產(chǎn)物最多各有3個，其中2個產(chǎn)物相同。熊去氧膽酸的氧化產(chǎn)物為圖1中的C、D、E，相對分子質(zhì)量分別為390.3、390.3及388.3，鵝去氧膽酸的氧化產(chǎn)物為圖1中D、E、F，相對分子質(zhì)量分別為390.3、388.3及390.3。熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸分別與PCC試劑氧化后的液質(zhì)聯(lián)用總離子流圖見圖2，其中峰1為熊去氧膽酸，峰7為鵝去氧膽酸，峰3與峰5的保留時間相同，負離子質(zhì)荷比均為m/z389.3；峰4與峰6的保留時間相同，負離子質(zhì)荷比均為m/z387.3。在正離子模式下，峰3與峰5的一級譜～四級譜均相同(其中一級譜見圖3)，峰4與峰6的一級譜～三級譜均相同(其中一級譜見圖4)。因此，推斷峰3與峰5為同一物質(zhì)，相對分子質(zhì)量為390.3，結構式為圖1中D；峰4與峰6為同一物質(zhì)，相對分子質(zhì)量為388.3，結構式為圖1中E。根據(jù)質(zhì)譜測定結果，可判斷峰2、峰8的相對分子質(zhì)量均為390.3，結構式分別為圖1中C、F。然后創(chuàng)建一個新譜庫，將峰1～峰8的各級質(zhì)譜圖一一錄入，作為對照圖譜。再將?；切苋パ跄懰帷⑴；蛆Z去氧膽酸、膽酸、去氧膽酸、牛磺膽酸對照品溶液的液質(zhì)聯(lián)用測定結果錄入同一譜庫，用于實際樣品的鑒別。

圖1 熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸及其氧化物的結構式

圖2 PCC氧化反應后的液質(zhì)聯(lián)用總離子流圖

圖3 峰3(或峰5)的離子阱質(zhì)譜一級譜

圖4 峰4(或峰6)的離子阱質(zhì)譜一級譜

3.2 痰熱清注射液及熊膽粉提取物中2個未知物的鑒別 痰熱清注射液和熊膽粉提取物的液質(zhì)聯(lián)用總離子流圖中均存在2個未知峰(見圖5)。該2個未知峰代表的化合物與作者前期研究中的2個未知物相同[3]。將圖5中峰2、峰4的測定結果與“3.1”項下的譜庫進行匹配分析，結果可推斷圖5中峰2對應的結構式為圖1中D，圖5中峰4對應的結構式為圖1中F。

圖5 熊膽粉提取物(A)及痰熱清注射液(B)的液質(zhì)聯(lián)用總離子流圖

3.3 痰熱清注射液中其他膽汁酸的鑒別 經(jīng)檢索譜庫，發(fā)現(xiàn)痰熱清注射液中含?；切苋パ跄懰?、膽酸、熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸以及“3.2”項下的2個膽汁酸氧化物(見圖6)。

圖 6 痰熱清注射液中膽汁酸鑒別結果

3.4 熊膽粉提取物中熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸及干燥失重的測定 熊膽粉提取物樣品的色譜圖見圖7，定量測定[3]結果見表1，其中百分比表示測得的熊去氧膽酸(或鵝去氧膽酸、干燥失重)的質(zhì)量(mg)占稱取量(mg)的百分比。

圖 7 熊膽粉提取物的HPLC圖

4 討論

4.1 PCC氧化反應的介質(zhì)一般用二氯甲烷[5-8]，但熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸難溶于二氯甲烷，故須另外選擇介質(zhì)。冰醋酸既可溶解PCC試劑，又可溶解熊去氧膽酸等膽汁酸，故本研究將其作為反應介質(zhì)。結果表明冰醋酸適用于熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸的PCC氧化反應，而且反應終溶液經(jīng)乙腈稀釋后可直接用于反相LC-MSn分析，操作簡便、快速。PCC試劑與熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸之間的摩爾數(shù)比可影響各產(chǎn)物的產(chǎn)率，該比值約為2∶11時，可同時產(chǎn)生3個氧化物，具體規(guī)律有待深入研究。熊膽氧化產(chǎn)物的結構需進一步明確。

表 1 熊膽粉提取物中成分測定及干燥失重結果

4.2 文獻[9-15]報道熊膽粉中含?；切苋パ跄懰?、?；蛆Z去氧膽酸、熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸、牛磺膽酸、?；侨パ跄懰?、膽酸、去氧膽酸、去氫膽酸等，主要含?；切苋パ跄懰?、?；蛆Z去氧膽酸。在制備熊膽粉提取物過程中，熊膽粉需經(jīng)過水解步驟。?；切苋パ跄懰?、?；蛆Z去氧膽酸可分別水解為熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸。故熊膽粉提取物主要含熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸。?；切苋パ跄懰岷湍懰岬暮辛烤^低，其測定方法將另行研究。

4.3 作者曾建立并驗證了痰熱清注射液中熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸的定量測定方法[3]。該方法驗證結果同樣適用于熊膽粉提取物的測定。因熊膽粉提取物可完全溶解于甲醇中，故提取回收率為100%。其余參數(shù)，如線性關系、精密度、穩(wěn)定性、重復性等，均無需另行驗證。

4.4 熊膽粉提取物中可能含殘留溶劑以及水分，本研究采用烘箱干燥法測定其總量。

參考文獻：

[1] 婁玉霞, 聶桂華, 劉乃強. HPLC-ELSD法測定痰熱清注射液中黃芩苷、熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸3種成分的含量[J]. 中國中藥雜志, 2009, 34(14):1862-1864.

[2] 王 玨, 瞿海斌, 邵 青. HPLC-UV-ELSD法同時測定痰熱清注射液中主成分含量[J]. 藥物分析雜志, 2009, 29(11):1804-1807.

[3] 簡龍海, 聞宏亮, 毛秀紅, 等. 痰熱清注射液中熊膽粉部分指紋圖譜和成分測定[J]. 中成藥, 2013, 35(1):113-117.

[4] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：2010年版一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社， 2010：附錄51-52.

[5] Corey E J, Suggs J W. Pyridinium chlorochromate, an effective reagent for oxidation of primary and secondary alcohol to carbonyl compounds[J].TetrahedronLett, 1975, 16(31):2647-2650.

[6] 崔建國, 黃立梁, 黃燕敏, 等. 一種具有抗腫瘤活性膽酸衍生物的合成新方法[J]. 有機化學, 2009, 29(6):971-974.

[7] 劉良先, 蔡 崑. Corey 氧化劑及其在選擇性氧化中的應用[J]. 化學通報, 1992(4):16-25.

[8] 張曉佳, 崔建國, 李 瑩, 等. 3β-羥基雄甾-4-烯-6, 17二酮合成的一種新方法[J]. 應用化學, 2010, 27(5):615-617.

[9] 張啟明, 袁惠南. 熊膽中膽汁酸類成分的研究述評[J]. 中國中藥雜志, 1994, 19(3):182-184.

[10] Yamaguchi S, Qian Z Z, Nohara T. Bile acids ofFelUrsi[J].ChemPharmBull, 1998, 46(10):1653-1655.

[11] Bi D, Chai X Y, Song Y L,etal. Novel bile acids from bear bile powder and bile of geese[J].ChemPharmBull, 2009, 57(5):528-531.

[12] 張 許, 王達祺, 劉買利. ?；切苋パ跬懰岱肿咏Y構的1H、13C NMR研究[J]. 波譜學雜志, 1999, 16(1):33-39.

[13] 朱麗玢, 洪筱坤. HPLC法定量分析熊膽中膽酸類化合物[J]. 中草藥, 2004, 35(11)：1255-1257.

[14] 王麗影, 高 昕, 佟子林, 等. 熊膽的化學成分、藥理作用及臨床研究概況[J]. 中醫(yī)藥信息, 2005, 22(4):30-33.

[15] 徐愚聰, 王 野. 熊膽粉的研究進展[J]. 華西藥學雜志, 2000, 15(3):200-202.