簡(jiǎn)龍海， 王 柯， 季 申

(上海市食品藥品檢驗(yàn)所，上海 201203)

痰熱清注射液處方由黃芩、熊膽粉、山羊角、金銀花、連翹五味中藥組成，成分復(fù)雜，其中與熊膽粉有關(guān)的化學(xué)成分分析僅見(jiàn)熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸的定量測(cè)定報(bào)道[1-3]。作者于近期測(cè)定了痰熱清注射液中熊膽粉部分的指紋圖譜[3]，結(jié)果指紋圖譜中除含熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸外，尚含2個(gè)響應(yīng)相對(duì)較高的未知物。經(jīng)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，該2個(gè)未知物可能為熊去氧膽酸或鵝去氧膽酸的氧化物。為確證其化學(xué)結(jié)構(gòu)，作者對(duì)熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸進(jìn)行了氧化，以液相色譜-離子阱質(zhì)譜法(LC-MSn)確證氧化產(chǎn)物，以氧化產(chǎn)物作為對(duì)照物進(jìn)行鑒別。為探索痰熱清注射液熊膽粉部分的物質(zhì)基礎(chǔ)，作者以現(xiàn)有對(duì)照品對(duì)其他可能含有的膽汁酸進(jìn)行了鑒別；采用HPLC法對(duì)中間體熊膽粉提取物進(jìn)行了成分定量測(cè)定；并測(cè)定了熊膽粉提取物的干燥失重。研究結(jié)果可為痰熱清注射液及熊膽粉提取物的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 1200型高效液相色譜儀-6330型離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Agilent公司)，1100型高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)。

1.2 試藥 熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸、?；切苋パ跄懰帷⑴；蛆Z去氧膽酸、膽酸、去氧膽酸、?；悄懰徕c對(duì)照品均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，批號(hào)分別為 0755-9003、110806-200303、816-200004、846-9702、1078-0013、724-9305、815-9702。氯鉻酸吡啶(PCC)試劑由上海晶純?cè)噭┯邢薰咎峁?，批?hào)20628。乙腈、甲醇、甲酸、冰醋酸均為色譜純，水為Millipore純化水。痰熱清注射液(批號(hào)100124)，熊膽粉提取物(批號(hào)090704、090705、090706、090707、090801、090803、090804、090806、090807、090902、090903、090905、091001、091004)均由上海凱寶藥業(yè)有限公司提供。

2 方法

2.1 指紋圖譜[3]中2個(gè)未知物(分別以Ⅰ、Ⅱ表示)的結(jié)構(gòu)研究色譜條件 Agilent SB C18色譜柱(2.1 mm×15 mm，3.5 μm)；流動(dòng)相為乙腈-0.05%甲酸(45∶55)；體積流量 0.3 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量1 μL。

2.2 鑒別其他膽汁酸的色譜條件 Waters Atlantis C18色譜柱(4.6 mm × 150 mm，5 μm)；流動(dòng)相由乙腈(A)和0.01%甲酸(B)組成，梯度洗脫(0 ～ 40 min，20% →50%A；40 ～ 80 min，50%A)；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量1 μL。

2.3 質(zhì)譜條件 電噴霧離子化源(ESI源)；干燥氣溫度 350 ℃，干燥氣體積流量10 L/min；霧化氣 35 psi (1psi=6.895 kPa)；源噴射電壓 3.5 kV；正、負(fù)離子模式；二級(jí)電壓(MS/MS Frag Ampl)1.0 V；掃描范圍m/z50～1 500。

2.4 對(duì)照品溶液的制備 分別取熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸、?；切苋パ跄懰?、?；蛆Z去氧膽酸、膽酸、去氧膽酸、?；悄懰徕c對(duì)照品各10 mg，精密稱定，分別置10 mL量瓶中，加甲醇使溶解并定容至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為1 mg/mL的貯備液。分別精密吸取各貯備液1 mL，置50 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為20 μg/mL的溶液。精密吸取20 μg/mL的溶液250 μL，置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，得500 ng/mL的溶液，供LC-MSn測(cè)定。

2.5 未知物Ⅰ、Ⅱ?qū)φ杖芤旱闹苽?經(jīng)研究，未知物Ⅰ、Ⅱ的相對(duì)分子質(zhì)量為390.3，但無(wú)法獲得相應(yīng)對(duì)照品。由于熊去氧膽酸(或鵝去氧膽酸)單羥基氧化物的相對(duì)分子質(zhì)量亦為390.3，故推測(cè)未知物Ⅰ、Ⅱ?yàn)樾苋パ跄懰?或鵝去氧膽酸)的氧化物。相應(yīng)對(duì)照品通過(guò)PCC氧化反應(yīng)進(jìn)行半合成。PCC試劑是一種溫和、高效的氧化劑，可將膽汁酸中的仲醇選擇性地氧化為酮而不會(huì)進(jìn)一步氧化為羧酸[5-7]。合成后溶液通過(guò)LC-MSn進(jìn)行分離分析。具體合成方法為：精密稱取8 mg(約0.02 mol)熊去氧膽酸對(duì)照品，精密加入8.8 mg (約 0.04 mol) PCC試劑，加10 mL冰醋酸，振搖使溶解，靜置2 h，精密吸取50 μL，置1 mL量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，供LC-MSn測(cè)定。精密稱取8 mg(約0.02 mol)鵝去氧膽酸對(duì)照品，同法操作。

2.6 供試品溶液的制備 取熊膽粉提取物0.15 g，精密稱定，置10 mL量瓶中，加甲醇振搖使溶解，用甲醇定容至刻度，搖勻，作為供試品溶液A，供LC-MSn分析和HPLC測(cè)定。取痰熱清注射液，作為供試品溶液B，供LC-MSn分析。

2.7 熊膽粉提取物中熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸的測(cè)定 按照文獻(xiàn)[3]方法進(jìn)行測(cè)定。

2.8 干燥失重測(cè)定 按照文獻(xiàn)[4]中的烘箱干燥法進(jìn)行測(cè)定。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)照譜庫(kù)的建立 熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸為立體異構(gòu)體(見(jiàn)圖1)，其兩個(gè)羥基均可被PCC試劑氧化成酮[5-8]，故熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸的氧化產(chǎn)物最多各有3個(gè)，其中2個(gè)產(chǎn)物相同。熊去氧膽酸的氧化產(chǎn)物為圖1中的C、D、E，相對(duì)分子質(zhì)量分別為390.3、390.3及388.3，鵝去氧膽酸的氧化產(chǎn)物為圖1中D、E、F，相對(duì)分子質(zhì)量分別為390.3、388.3及390.3。熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸分別與PCC試劑氧化后的液質(zhì)聯(lián)用總離子流圖見(jiàn)圖2，其中峰1為熊去氧膽酸，峰7為鵝去氧膽酸，峰3與峰5的保留時(shí)間相同，負(fù)離子質(zhì)荷比均為m/z389.3；峰4與峰6的保留時(shí)間相同，負(fù)離子質(zhì)荷比均為m/z387.3。在正離子模式下，峰3與峰5的一級(jí)譜～四級(jí)譜均相同(其中一級(jí)譜見(jiàn)圖3)，峰4與峰6的一級(jí)譜～三級(jí)譜均相同(其中一級(jí)譜見(jiàn)圖4)。因此，推斷峰3與峰5為同一物質(zhì)，相對(duì)分子質(zhì)量為390.3，結(jié)構(gòu)式為圖1中D；峰4與峰6為同一物質(zhì)，相對(duì)分子質(zhì)量為388.3，結(jié)構(gòu)式為圖1中E。根據(jù)質(zhì)譜測(cè)定結(jié)果，可判斷峰2、峰8的相對(duì)分子質(zhì)量均為390.3，結(jié)構(gòu)式分別為圖1中C、F。然后創(chuàng)建一個(gè)新譜庫(kù)，將峰1～峰8的各級(jí)質(zhì)譜圖一一錄入，作為對(duì)照?qǐng)D譜。再將牛磺熊去氧膽酸、牛磺鵝去氧膽酸、膽酸、去氧膽酸、牛磺膽酸對(duì)照品溶液的液質(zhì)聯(lián)用測(cè)定結(jié)果錄入同一譜庫(kù)，用于實(shí)際樣品的鑒別。

圖1 熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸及其氧化物的結(jié)構(gòu)式

圖2 PCC氧化反應(yīng)后的液質(zhì)聯(lián)用總離子流圖

圖3 峰3(或峰5)的離子阱質(zhì)譜一級(jí)譜

圖4 峰4(或峰6)的離子阱質(zhì)譜一級(jí)譜

3.2 痰熱清注射液及熊膽粉提取物中2個(gè)未知物的鑒別 痰熱清注射液和熊膽粉提取物的液質(zhì)聯(lián)用總離子流圖中均存在2個(gè)未知峰(見(jiàn)圖5)。該2個(gè)未知峰代表的化合物與作者前期研究中的2個(gè)未知物相同[3]。將圖5中峰2、峰4的測(cè)定結(jié)果與“3.1”項(xiàng)下的譜庫(kù)進(jìn)行匹配分析，結(jié)果可推斷圖5中峰2對(duì)應(yīng)的結(jié)構(gòu)式為圖1中D，圖5中峰4對(duì)應(yīng)的結(jié)構(gòu)式為圖1中F。

圖5 熊膽粉提取物(A)及痰熱清注射液(B)的液質(zhì)聯(lián)用總離子流圖

3.3 痰熱清注射液中其他膽汁酸的鑒別 經(jīng)檢索譜庫(kù)，發(fā)現(xiàn)痰熱清注射液中含?；切苋パ跄懰?、膽酸、熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸以及“3.2”項(xiàng)下的2個(gè)膽汁酸氧化物(見(jiàn)圖6)。

圖 6 痰熱清注射液中膽汁酸鑒別結(jié)果

3.4 熊膽粉提取物中熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸及干燥失重的測(cè)定 熊膽粉提取物樣品的色譜圖見(jiàn)圖7，定量測(cè)定[3]結(jié)果見(jiàn)表1，其中百分比表示測(cè)得的熊去氧膽酸(或鵝去氧膽酸、干燥失重)的質(zhì)量(mg)占稱取量(mg)的百分比。

圖 7 熊膽粉提取物的HPLC圖

4 討論

4.1 PCC氧化反應(yīng)的介質(zhì)一般用二氯甲烷[5-8]，但熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸難溶于二氯甲烷，故須另外選擇介質(zhì)。冰醋酸既可溶解PCC試劑，又可溶解熊去氧膽酸等膽汁酸，故本研究將其作為反應(yīng)介質(zhì)。結(jié)果表明冰醋酸適用于熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸的PCC氧化反應(yīng)，而且反應(yīng)終溶液經(jīng)乙腈稀釋后可直接用于反相LC-MSn分析，操作簡(jiǎn)便、快速。PCC試劑與熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸之間的摩爾數(shù)比可影響各產(chǎn)物的產(chǎn)率，該比值約為2∶11時(shí)，可同時(shí)產(chǎn)生3個(gè)氧化物，具體規(guī)律有待深入研究。熊膽氧化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)需進(jìn)一步明確。

表 1 熊膽粉提取物中成分測(cè)定及干燥失重結(jié)果

4.2 文獻(xiàn)[9-15]報(bào)道熊膽粉中含?；切苋パ跄懰帷⑴；蛆Z去氧膽酸、熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸、牛磺膽酸、牛磺去氧膽酸、膽酸、去氧膽酸、去氫膽酸等，主要含?；切苋パ跄懰帷⑴；蛆Z去氧膽酸。在制備熊膽粉提取物過(guò)程中，熊膽粉需經(jīng)過(guò)水解步驟。?；切苋パ跄懰?、牛磺鵝去氧膽酸可分別水解為熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸。故熊膽粉提取物主要含熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸。?；切苋パ跄懰岷湍懰岬暮辛烤^低，其測(cè)定方法將另行研究。

4.3 作者曾建立并驗(yàn)證了痰熱清注射液中熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸的定量測(cè)定方法[3]。該方法驗(yàn)證結(jié)果同樣適用于熊膽粉提取物的測(cè)定。因熊膽粉提取物可完全溶解于甲醇中，故提取回收率為100%。其余參數(shù)，如線性關(guān)系、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性等，均無(wú)需另行驗(yàn)證。

4.4 熊膽粉提取物中可能含殘留溶劑以及水分，本研究采用烘箱干燥法測(cè)定其總量。

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