黃文強，張志剛，鄭 玲，辛雪梅，彭大新

(1.揚州大學獸醫(yī)學院，江蘇揚州 225000；2.上海東方希望集團上海畜牧有限公司，上海 200000)

豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一種高致死性、接觸性傳染病[1-3]，其發(fā)病特征以嘔吐、腹瀉、脫水、電解質(zhì)紊亂為主，各種年齡階段和不同品種的豬群都有易感性，且對哺乳仔豬、架子豬或育肥豬的危害更大[4]，尤其是哺乳仔豬受害最為嚴重，發(fā)病率高達100%，病死率為30%～80%[5]。

PEDV的形態(tài)是典型的冠狀病毒形態(tài)[6]，形態(tài)學呈現(xiàn)多形性，近似于球形，病毒的外部有囊膜，囊膜上有纖突，纖突之間的間距較大，并且排列比較規(guī)范，呈花瓣樣放射狀，纖突的長度約為20 nm左右，PEDV粒子的大小為95 nm～190 nm，平均直徑為130 nm。核酸為線性單股正鏈RNA[7]，其表面具有3種結(jié)構(gòu)蛋白，即纖突蛋白(S)、膜蛋白(M)和包膜蛋白(E)[8]。其中M蛋白位于PEDV的囊膜表面，是囊膜上含量最多的蛋白，在不同的PEDV毒株之間具有相對保守性，常常使用其作為建立PEDV的RT-PCR方法和流行病學的研究工具的靶基因[9]。

該病從2010年開始嚴重暴發(fā)流行，原有疫苗保護效果較差，提示可能存在變異株[10-13]。近年來PED流行范圍不斷擴大，呈現(xiàn)地方流行性，是嚴重威脅我國和全球生豬養(yǎng)殖的重要疫病。為了進一步研究該病原的致病性特征，加強對PED的防控，本研究從江蘇省某豬場發(fā)生疫情的5日齡仔豬糞便和腸道中分離1株P(guān)EDV，以期為PEDV的致病機理研究和疫苗研制提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料與細胞 無菌采集江蘇某豬場5日齡腹瀉仔豬的小腸及內(nèi)容物，置-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。Vero細胞為中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所保存。

1.1.2 主要試劑 RNA提取試劑盒、DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒、PremixTaqTMTaKaRaTaqTMVersion 2.0)、PrimeScriptTaqTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit、DL 2 000 DNA Marker，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗(青霉素、鏈霉素)，Hyclone公司產(chǎn)品；胰酶，Gibco公司產(chǎn)品。

1.1.3 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank中AF353511.1序列設(shè)計擴增PEDV M基因的引物，PEDV-F/R分別為5′-AACGGTTCTATTCCCGTTGATG-3′和5′-TAAATGAAGCACTTTCTCACTATA-3′,預(yù)期擴增長度為663 bp。豬瘟病毒(CSFV)[14]、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬細小病毒(PPV)[15]、豬傳染性胃腸炎病毒(TEGV)、豬輪狀病毒(PRV)[16]引物序列參考已發(fā)表論文中的引物序列；所有引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.1.4 主要儀器 生物安全柜，MVE公司產(chǎn)品；酶聯(lián)免疫檢測儀，Bioteck公司產(chǎn)品；CO2培養(yǎng)箱，NVAIRE公司產(chǎn)品；倒置熒光顯微鏡，Olympus公司產(chǎn)品；-80℃超低溫冰箱、PCR儀，美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品；凝膠成像儀，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 病料處理 將病料加入5倍體積含雙抗(青霉素100 IU/mL，鏈霉素100 μg/mL，pH7.2)的PBS溶液(pH7.2)研磨，反復(fù)凍融3次，8 000 r/min離心10 min，無菌吸取上清液，用0.22 μm濾器過濾后置-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 RT-PCR檢測 取1.2.1處理過的病料上清，根據(jù)TaKaRa公司RNA/DNA提取試劑盒說明書，進行病毒RNA/DNA的提取，將提取出來的RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA。對提取出的cDNA和DNA進行豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬細小病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬輪狀病毒的PCR鑒定，檢測體系和條件按常規(guī)檢測方法操作。

1.2.3 病毒分離 復(fù)蘇Vero細胞，將長成單層致密的Vero細胞棄去培養(yǎng)液，用MEM洗3遍后按10%的接毒量加入處理好且PEDV檢測結(jié)果為陽性，其他病毒檢測結(jié)果為陰性的病料上清，37℃吸附1 h后，加入終濃度為10 μg/mL胰酶的維持液[10]，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后盲傳，同時設(shè)不加病料上清的終濃度為10 μg/mL胰酶維持液的Vero細胞作為健康對照。當觀察到細胞病變后，采集培養(yǎng)液上清，連續(xù)傳代2次。

1.2.4 病毒含量的測定 用MEM培養(yǎng)基將毒種做10倍系列稀釋，取10-5、10-6、10-7、10-84個稀釋度，分別接種已長成良好單層的Vero細胞96孔細胞培養(yǎng)板，每個稀釋度接種6孔，100 μL/孔，置37℃作用1 h，棄液，加入MEM培養(yǎng)基，100 μL/孔，同時設(shè)正常細胞對照，置37℃、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，每日觀察并記錄細胞病變(CPE)，按Reed-Muench法計算TCID50，距離比例=(高于50%病變率的百分數(shù)-50%)/(高于50%病變率的百分數(shù)-低于50%病變率的百分數(shù))。

1.2.5 M基因序列分析 取1 μL的TaKaRa隨機引物、1 μL dNTP Mixture (10 mmol/L each)，加入8 μL總RNA中，置于65℃金屬浴5 min后，冰上迅速冷卻。于上述變性后反應(yīng)液中加入5×buffer 4 μL，Prime Script Ⅱ RTase (200 U/μL)反轉(zhuǎn)錄酶1 μL，RNA酶抑制劑0.5 μL，RNase Freed dH2O 4.5 μL總體積20 μL。反應(yīng)條件：42℃反轉(zhuǎn)錄1 h，95℃ 5 min后，冰上冷卻。

取上述2 μL cDNA作為模板進行RT-PCR，反應(yīng)按如下體系在PCR管中進行，2×PremixTaq25 μL，引物PEDV-F、PEDV- R各1 μL，滅菌水21 μL，總體積50 μL。反應(yīng)條件為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，共30個循環(huán)；最后 72℃延伸10 min。

將電泳結(jié)果為陽性的PCR產(chǎn)物，按照TaKaRa公司的膠回收試劑盒說明書進行PCR產(chǎn)物純化，純化后由蘇州金唯智生物科技有限公司測序。利用DNA Star軟件進行分析，使用Mega 7軟件對NJ方法對核苷酸序列進行遺傳進行分析。

1.2.6 動物回歸試驗 將10頭7日齡仔豬隨機分為感染組(n=5)和對照組(n=5)。感染組每頭仔豬口服2 mL含量為106.0TCID50/mL的病毒；對照組每頭仔豬口服相同體積的PBS。接種后每日觀察仔豬臨床表現(xiàn)并記錄，對出現(xiàn)嚴重腹瀉或垂死的仔豬給予安樂死。

1.2.7 半數(shù)致死量試驗 將18頭7日齡仔豬隨機分為4組，第1、2、3組為試驗組，每組5頭豬；試驗組分別口服接種2 mL，病毒含量依次為104.5、105.5、106.5TCID50/mL的F6代分離株。第4組為對照組，3頭豬，每頭仔豬口服相同體積的細胞培養(yǎng)液。接種后每日觀察仔豬臨床表現(xiàn)并記錄，連續(xù)觀察10 d。試驗結(jié)束時，統(tǒng)計各組仔豬的死亡率，按照Reed-Muench法計算其半數(shù)致死量(LD50)。

2 結(jié)果

2.1 腹瀉病原RT-PCR檢測

將提取的DNA及RNA進行7種病毒(PCV2、CSFV、PRRSV、PPV、TEGV、PEDV、RV)的PCR檢測，其中1份DNA/RNA樣品成功擴增出長度約為663 bp的目的片段(圖1)。將PCR產(chǎn)物進行純化后，送至蘇州金唯智生物科技有限公司測序，測序結(jié)果表明，與GenBank上PEDV M基因同源性高達99%以上。

2.2 病毒分離

PEDV陽性病料接種Vero細胞后，盲傳到F4代，出現(xiàn)明顯病變，主要表現(xiàn)為細胞表面粗糙，顆粒增多，有多核細胞，并可見空斑樣小區(qū)，細胞脫落等病變特征(圖2A)。而對照細胞保持致密的單層，呈長梭形，輪廓清晰，細胞脫落極少(圖2B)。將分離株命名為PEDV JS14株。將PEDV JS14株連續(xù)傳代至F6代，細胞病變比較穩(wěn)定，對分離得到的F4代～F6代PEDV JS14株的病毒含量進行測定，并使用Reed-Muench方法進行計算，結(jié)果表明，F(xiàn)4代病毒含量為105.5TCID50/mL，F(xiàn)5代病毒含量為106.0TCID50/mL，F(xiàn)6代病毒含量為106.5TCID50/mL。

M.DNA 標準DL 2 000;1、3、5、7、9、11、13.分別PPV、CSFV、PRRSV、RV、TEGV、PCV2和PEDV的陽性對照；2、4、6、8、10、12、14.分別是以病料為DNA/cDNA進行PPV、CSFV、PRRSV、RV、TEGV、PCV2和PEDV的核酸擴增結(jié)果

A.接毒后的細胞;B.正常Vero細胞A.Vero cells after inoculation;B.Normal Vero cells

2.3 分離毒株M基因序列分析

對F0代～F8代細胞培養(yǎng)物提取核酸進行RT-PCR擴增，產(chǎn)物大小與預(yù)期一致(圖3)?；厥誔CR產(chǎn)物，送往蘇州金唯智生物科技有限公司測序。將獲得的JS14株M基因序列與國內(nèi)外具有代表性的19株P(guān)EDV毒株進行同源性比對分析，發(fā)現(xiàn)其與KF272920.1同源性最高，達到99.9%(圖4)。M基因遺傳進化分析表明，JS14株與美國分離毒株KF272920.1屬于同一分支，具有較近的親緣關(guān)系，而與經(jīng)典毒株CV777存在一定進化距離(圖5)。

圖4 PEDV M基因序列同源性比對

圖5 PEDV M基因遺傳進化分析

2.4 動物回歸試驗

試驗組5頭7日齡仔豬口服接種JS14株F6代10 h后，均出現(xiàn)厭食、嘔吐、腹瀉等癥狀；30 h后癥狀加重，4頭仔豬死亡；42 h后剩余1頭仔豬出現(xiàn)水樣糞便、內(nèi)有凝乳樣白色和淡黃色塊狀物，被毛粗糙，仔豬消瘦明顯等癥狀。試驗期間，對照組仔豬未出現(xiàn)上述臨床癥狀。剖檢病死豬發(fā)現(xiàn)，小腸擴張，部分腸壁變薄呈透明狀有出血點，腸系膜充血顯示(圖6A～圖6D)。試驗結(jié)果表明，JS14分離株接種仔豬后，可引起PED典型的臨床癥狀，結(jié)合RT-PCR、細胞病變觀察結(jié)果，最終確定該分離毒株為PEDV強毒株。

M.DNA 標準DL 2 000;1.陰性對照；2.陽性對照；3～11.分別為F0～F8的細胞培養(yǎng)物的核酸；12～17.分別為F8代細胞培養(yǎng)物的PPV、CSFV、PRRSV、RV、TEGV、PCV2鑒定

A.淡黃色嘔吐物；B.淡黃色水樣糞便；C.小腸部分腸壁變薄呈透明狀有出血點；D.腸系膜充血

2.5 半數(shù)致死量

將PEDV JS41株F6代病毒液口服接種7日齡人工哺乳仔豬，觀察期內(nèi)，不同病毒滴度(106.5、105.5、104.5TCID50/mL)的試驗組均出現(xiàn)典型臨床癥狀，主要表現(xiàn)為嘔吐、腹瀉、水樣糞便等癥狀。接種滴度為106.5TCID50/mL的5頭仔豬全部死亡，發(fā)病率為100%，病死率為100%。接種滴度為105.5TCID50/mL的5頭仔豬中，有4頭死亡，發(fā)病率為100%，病死率為80%。接種滴度為104.5TCID50/mL的5頭仔豬中，有1頭死亡，發(fā)病率為60%，病死率為20%(表1)。Reed-Muench法計算結(jié)果表明，其半數(shù)致死量為105.0TCID50/mL。

表1 JS14株感染7日齡仔豬發(fā)病率及死亡率

3 討論

本試驗通過對發(fā)病豬場10日齡內(nèi)腹瀉仔豬的糞便和病死豬小腸內(nèi)容物進行PEDV病原的RT-PCR檢測，同時對該陽性病料進行了外源病毒檢測(PCV2、PRRSV、CSFV、TEGV、RV、PPV)篩選出一份PEDV結(jié)果呈陽性，其他病毒檢測結(jié)果為陰性的樣品。將該陽性病料接種Vero細胞，進行PEDV的初步分離工作。PEDV分離方面，我國報道較早的是李樹根等[17]采用添加胰酶的細胞維持液成功地將分離的PEDV適應(yīng)于Vero，并篩選出了最佳的胰酶用量。本試驗通過在維持液中加入10 μg/mL胰酶，成功的分離到了可在Vero細胞系上產(chǎn)生穩(wěn)定細胞病變的PEDV JS14株，該毒株在盲傳第4代時出現(xiàn)病變，提示病毒已經(jīng)適應(yīng)了Vero細胞，將PEDV JS14株連續(xù)傳代至F6代，細胞病變比較穩(wěn)定，其病毒含量達到106.5TCID50/mL。與之前分離的毒株相比，其病毒滴度高于早年間發(fā)現(xiàn)的毒株，例如：PEDV-HZ(病毒滴度為105.7TCID50/mL)、PEDV SD201604株(病毒滴度為103.5TCID50/mL)[18-19]。

本試驗對PEDV JS14株致病性進行了初步研究，在攻毒10 h后，5頭仔豬均出現(xiàn)厭食、嘔吐、腹瀉等癥狀；攻毒30 h后，3頭仔豬死亡；攻毒42 h后，剩余2頭仔豬出現(xiàn)水樣糞便、內(nèi)有凝乳樣白色和淡黃色塊狀物，被毛粗糙，仔豬消瘦明顯等癥狀，而對照組仔豬未出現(xiàn)上述臨床癥狀。與PEDV TX株相比[20]，試驗動物出現(xiàn)典型癥狀時間早，病程長，發(fā)病癥狀嚴重，說明本研究分離的毒株，病毒含量高，致病性強。M基因的遺傳進化樹顯示與美國分離株KF272920.1同源性最高，可能與種豬引進的來源有關(guān)，需對其他基因進行序列分析來進一步驗證。

綜上所述，本研究成功分離到1株豬流行性腹瀉病毒，將其命名為PEDV JS14株，并將JS14毒株在Vero細胞上連續(xù)傳代培養(yǎng)。通過細胞病變、RT-PCR檢測進行鑒定，動物回歸試驗證實為PEDV強毒株，為PEDV的生物學特性的進一步研究提供了參考。