陳宋琴，李才善，葛曉敏，韋麗婷，劉一凡，祖利亞·克力木江，馬 英，郭慶勇

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052)

牛梨形蟲及牛無漿體均屬于蜱傳病原(tick-borne pathogen)，通過硬蜱叮咬宿主方式進行傳播[1]。家畜感染這些病原所引起的疾病會表現(xiàn)出一系列的臨床癥狀，致使其生產(chǎn)力降低，給牧民帶來巨大的經(jīng)濟巨大損失。新疆地區(qū)感染牛的主要蜱傳病原為環(huán)形泰勒蟲(Theileriaannulata)、雙芽巴貝斯蟲(Babesiabigemina)及牛無漿體(Anaplasmabovis)[2]。環(huán)形泰勒蟲(T.annulata)引起的疾病主要臨床特征為高熱、貧血、消瘦和周身淋巴結(jié)腫脹，并引起致死性白細胞增殖紊亂[3]。感染雙芽巴貝斯蟲(B.bigemina)的家畜臨床癥狀表現(xiàn)為高熱、貧血、血紅蛋白尿甚至死亡[4]。牛無漿體(A.bovis)屬于立克次體目、無漿體科和無漿體屬，是一類經(jīng)蜱傳播的胞內(nèi)寄生菌，主要寄生于哺乳動物的血細胞中，牛、羊和鹿中最常見[5]。其引起疾病的臨床癥狀以體溫升高、體重降低、虛弱無力、黏膜蒼白、淋巴結(jié)炎甚至死亡為主要特征。

新疆吐魯番和阿勒泰等地區(qū)畜牧養(yǎng)殖主要以放牧形式為主[6]，家畜很容易被蜱蟲叮咬而被感染蜱傳病原。因此，本試驗以吐魯番和阿勒泰地區(qū)為試驗點，以牛為研究對象，對牛環(huán)形泰勒蟲(T.annulata)、牛雙芽巴貝斯蟲(B.bigemina)和牛無漿體(A.bovis)進行PCR檢測并分別基于Tams1基因、Rap1α基因、16S rRNA基因構(gòu)建系統(tǒng)樹進行進化分析。通過對3種病原及其混合感染情況進行調(diào)查，為該地區(qū)掌握3種病原的感染狀況及為防治提供數(shù)據(jù)支持，以助于提出該地區(qū)科學(xué)、合理的防治措施，以期減少此類病原為牧民帶來的經(jīng)濟損失。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 2018年7月至2019年6月共采集120份牛血液樣品,其中阿勒泰地區(qū)70份、吐魯番地區(qū)50份。通過頸靜脈采血方法，采集1.5歲以上牛的全血，將其分裝入含有EDTA的抗凝管中，置于4℃環(huán)境中，將血液樣品裝入冰盒中轉(zhuǎn)運到新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院寄生蟲實驗室。

1.1.2 主要試劑 血液DNA提取試劑盒、2×EcoTaqPCR Super Mix ，天根試劑公司產(chǎn)品；膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA提取試劑盒，美國Axygen 公司產(chǎn)品；PEASY-T1 載體，北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；DH5α感受態(tài)細胞，Takara公司產(chǎn)品；引物探針由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 PEASY-T1載體，北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；DH5α感受態(tài)細胞，Takara公司產(chǎn)品；RADIAL20型臺式高速離心機，西班牙ORTO ALRESA公司產(chǎn)品；PCR儀、Gel Doc2000紫外凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 牛全血DNA提取 按照天根血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒說明書提取牛血DNA,置于-20℃保存。

1.2.2 3種蜱傳病原檢測 利用PCR技術(shù)對牛環(huán)形泰勒蟲、牛雙芽巴貝斯蟲及牛無漿體病原進行檢測。利用DNA Man及Premier 5.0軟件設(shè)計1對牛環(huán)形泰勒蟲特異性引物,并參考TERKAWI[7]設(shè)計的牛雙芽巴貝斯蟲和REYE[8]設(shè)計的牛無漿體的特異性引物。PCR反應(yīng)退火溫度根據(jù)其引物片段中的GC含量來計算，引物見表1。

以提取牛全血基因組DNA為模板，PCR反應(yīng)體系為50 μL，2×EcoTaqPCR Super Mix 所加體系為25 μL，上游和下游引物各加2 μL，模板DNA加入2 μL，最后雙蒸水至50 μL。

PCR反應(yīng)條件：95℃ 5 min；94℃ 30 s，退火溫度根據(jù)表1設(shè)定，退火時間為30 s，72℃ 1 min，35個循環(huán)；72℃ 10 min。PCR結(jié)束后，取5 μL擴增產(chǎn)物進行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，20 min 后觀察電泳結(jié)果。

表1 檢測3種蜱傳病原所使用的引物序列

1.2.3 測序和系統(tǒng)發(fā)育分析 按照北京全式金生物技術(shù)有限公司pEASY-T1 Cloning Kit說明書，將回收的目的片段3 μL與1 μL pEASY-T1 載體連接,導(dǎo)入到50 μL 大腸埃希氏菌DH5α 感受態(tài)細胞中，并涂板篩選陽性菌株，獲得重組質(zhì)粒，將挑選好的菌株進行培養(yǎng)，按照美國Axygen公司的質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒說明書進行質(zhì)粒提取。以提取的重組質(zhì)粒為模板進行PCR鑒定，挑選PCR鑒定為陽性的重組質(zhì)粒送往上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行測序。

測定的基因序列先在DNA Man上進行比對，再在NCBI網(wǎng)站上經(jīng)BLAST進行同源性比對。并從GenBank上獲得其他已報道的3種蜱傳病原相關(guān)基因序列。運用MEGA 6.0軟件中ML方法，以T92+G+I模型分別分析計算這3種病原的種間遺傳距離。牛環(huán)形泰勒蟲(T.annulata)、牛雙芽巴貝斯蟲(B.bigemina)和牛無漿體(A.bovis)分別選用牛巴貝斯蟲(Babesiabovis)、吉氏巴貝斯蟲(Babesiagibsoni)和牛環(huán)形泰勒蟲(T.annulata)為外立群。

2 結(jié)果

2.1 3種病原PCR檢測結(jié)果

根據(jù)表1所示引物序列，牛環(huán)形泰勒蟲、牛雙芽巴貝斯蟲及牛無漿體經(jīng)PCR擴增后，分別在瓊脂糖凝膠電泳上出現(xiàn)了768、412、551 bp大小目的片段，其電泳結(jié)果分別如圖1、圖2和圖3所示。

M.DNA標(biāo)準DL 2 000; 1～7.檢測樣品；8.陰性對照M.DNA Marker DL 2 000;1-7.Test samples;8.Negative control

M.DNA標(biāo)準DL 2 000; 1～9.檢測樣品；10.陰性對照M.DNA Marker DL 2 000;1-9.Test samples;10.Negative control

2.2 3種病原的感染情況

各個地區(qū)病原感染情況見圖4。在120份牛血樣品中，利用PCR與套式PCR方法進行病原學(xué)檢測，發(fā)現(xiàn)58頭牛感染了1種～3種病原，3種病原檢測調(diào)查情況見表2。由表2可知，牛環(huán)形泰勒蟲的感染率最高為20.8%(25/120)，阿勒泰地區(qū)的感染率21.1%(15/70)比吐魯番地區(qū)20.0%(10/50)感染率高。其次是牛雙芽巴貝斯蟲14.2%(17/120)，吐魯番地區(qū)的感染率24.0%(12/50)是阿勒泰地區(qū)7.1%(5/120)的1倍。牛無漿體感染率最低11.7%(14/120)，且阿勒泰地區(qū)11.4%(8/120)與吐魯番地區(qū)12.0%(6/120)的感染率相同。運用SPSS軟件中的單因素分析方法，對兩地區(qū)感染情況進行差異顯著性分析，P>0.05,表示兩地區(qū)的3種病原感染率差異不顯著。

表2 3種病原檢測調(diào)查情況

M.DNA標(biāo)準DL 2 000; 1～9.檢測樣品；10.陰性對照M.DNA Marker DL 2 000;1-9.Test samples;10.Negative control

圖4 3種病原檢測結(jié)果Fig.4 Detection results of three pathogens

2.3 3種病原混合感染情況

在感染的56份牛血樣品中，有28頭牛感染2種～3種病原(感染2種病原23份，感染3種病原5份)，最常見的混合感染性病原是牛環(huán)形泰勒蟲和牛雙芽巴貝斯蟲(9/56)，其余2種混合感染情況相同(7/56),3種病原混合感染情況出現(xiàn)5例(表3)。

表3 3種病原混合感染情況調(diào)查

2.4 遺傳進化分析

經(jīng)測序得到的吐魯番地區(qū)與阿勒泰地區(qū)3種病原序列分別在NCBI上進行同源性比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，其比對結(jié)果分別為環(huán)形泰勒蟲、牛雙芽巴貝斯蟲與牛無漿體系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5、圖6和圖7)。

系統(tǒng)發(fā)育表明阿勒泰地區(qū)牛環(huán)形泰勒蟲與突尼斯株(登錄號：AF214870.1)形成了一簇，而吐魯番地區(qū)的環(huán)形泰勒蟲單獨一簇。兩個地區(qū)的牛雙芽巴貝斯蟲與印度尼西亞株(登錄號：KY484520.1)和泰國株(登錄號：AB594816.1)屬于同一簇。牛無漿體與伊朗(登錄號：KP017262)在同一分支上。

3 討論

新疆作為全國畜牧養(yǎng)殖大區(qū)，牛、羊養(yǎng)殖業(yè)是主要的畜牧業(yè)之一，根據(jù)之前相關(guān)文獻報道[9]，有不少地區(qū)牛感染過環(huán)形泰勒蟲、雙芽巴貝斯蟲及牛無漿體，并給當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失[10]。

▲為牛環(huán)形泰勒蟲Tams1基因序列▲The Tams1 gene sequence of T.annulata was determined in this paper

▲為牛無漿體16S rRNA基因序列▲ means the 16S rRNA sequence of A.bovis was determined in this paper

通過PCR和套式PCR對牛環(huán)形泰勒蟲、牛雙芽巴貝斯蟲和牛無漿體檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，吐魯番地區(qū)的3種蜱傳病原總體感染率56.0%(28/50)高于阿勒泰地區(qū)40%(40/70)，這可能是由于吐魯番地區(qū)存在更加豐富的媒介蜱蟲種類。于心[11]對新疆地區(qū)分布的蜱蟲進行調(diào)查，在天山山地發(fā)現(xiàn)的蜱種類是阿勒泰地區(qū)的6倍，吐魯番市位于天山山地東部，因此，其家畜感染蜱傳病原的機率就會更高。并且兩個地區(qū)都是牛環(huán)形泰勒蟲的感染率最高，說明璃眼蜱可能是當(dāng)?shù)貎?yōu)勢媒介蜱之一。海尼木古力·艾合買提[12]對吐魯番市托克遜縣進行媒介蜱的鑒定，從所采的547只蜱中共檢測到517只都是殘緣璃眼蜱，劉繼榮等[13]對阿勒區(qū)硬蜱區(qū)系研究中發(fā)現(xiàn)，璃眼蜱屬占總蜱數(shù)的40%。因此，當(dāng)?shù)氐沫h(huán)形泰勒蟲和牛無漿體的感染率都較高。

本調(diào)查觀察到有28頭牛感染2種～3種病原(感染2種病原23份、感染3種病原5份)，混合感染率最高的是牛環(huán)形泰勒蟲和牛雙芽巴貝斯蟲，牛環(huán)形泰勒蟲幾乎與其他所有病原都出現(xiàn)混合感染，說明牛環(huán)形泰勒蟲是最有可能出現(xiàn)混合感染的潛在病原。在新疆，牛通常與馬、綿羊和山羊一起放牧，混合放牧條件使蜱蟲更容易在動物之間爬行傳播病原，從而使家畜增加混合感染的可能性。根據(jù)文獻記錄，殘緣璃眼蜱[14-15]既可以傳播環(huán)形泰勒蟲也可以傳播牛無漿體，這種攜帶多種病原的媒介蜱也是使家畜出現(xiàn)混合感染的原因之一。Li Y C等[16]對新疆牛雙芽巴貝斯蟲、牛巴貝斯蟲、牛無漿體及立克次體混合感染進行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，這4種病原都會存在混合感染的情況，因此，試驗點可能還會出現(xiàn)其他混合感染的潛在病原。根據(jù)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，感染多種病原的?？赡鼙雀腥疽环N病原的牛有更明顯的臨床癥狀，其癥狀表現(xiàn)復(fù)雜且有可能導(dǎo)致病情加重[10]。

調(diào)查中利用PCR方法擴增出的牛環(huán)形泰勒蟲、牛雙芽巴貝斯蟲及牛無漿體序列經(jīng)NCBI上的Blast進行比對的結(jié)果分別為95%～98%、99%～100%、96%～99%，說明所擴增的片段都存在高度的保守性。根據(jù)這些基因所構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹發(fā)現(xiàn)，本試驗獲得的牛環(huán)形泰勒蟲株與突尼斯蟲株，牛雙芽巴貝斯蟲與泰國株和印度尼西亞株，牛無漿體與伊朗株在同一分支上，都表現(xiàn)為較近的親緣關(guān)系。

調(diào)查結(jié)果表明，牛環(huán)形泰勒蟲、牛雙芽巴貝斯蟲和牛無漿體在新疆阿勒泰和吐魯番兩個地區(qū)均有感染的情況，且同一頭牛還會感染2種～3種病原。此次研究對吐魯番和阿勒泰地區(qū)這3種病原及其混合感染進行調(diào)查，從而為這兩個地區(qū)蜱傳病原的分布提本數(shù)據(jù)支撐，增強當(dāng)?shù)啬撩駥ο嚓P(guān)疾病的預(yù)防，媒介蜱的驅(qū)除及病原的檢測，減少當(dāng)?shù)啬撩窠?jīng)濟損失。