楊澤曉,曾紅梅,涂 騰,桑杰益西,李 敏,任永軍,羅 燕,姚學萍,王 印*,陳 斌

(1.四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，四川成都 611130；2.成都市動物疫病預防控制中心，四川成都 610041；3.四川省畜牧科學研究院，四川成都 610066；4.四川省動物疫病預防控制中心，四川成都 610041)

兔病毒性出血癥(Rabbit hemorrhagic disease，RHD)又稱兔瘟，是由嵌杯病毒科(Caliciviridae)兔病毒屬(Lagovirus)兔出血癥病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV)引起家兔的一種急性、高度致死性傳染病。該病典型病變特征以呼吸系統(tǒng)出血，實質(zhì)器官淤血、腫大、出血和肝臟壞死為主。RHD因其潛伏期短、發(fā)病急、病程短、傳播快，病死率可高達100%，被我國列為二類動物疫病[1]。兔瘟包括兔瘟1型(RHD1)和兔瘟2型(RHD2)。RHD1出現(xiàn)較早，自我國1984年報道以后世界很多國家相繼出現(xiàn)RHD的發(fā)生和流行[1-2]，由于免疫接種等防控措施的實施，RHD1的流行得到基本控制，但偶爾有疑似病例或疫情發(fā)生的報道[2-3]，并且不同基因型和抗原型的RHDV變異株不斷被發(fā)現(xiàn)[4-5]。

RHD2于2010年由法國首次報道，由一種由RHDV新變異毒株兔出血癥病毒2型引起的新型兔病毒性出血癥(new rabbit hemorrhagic disease，nRHD)即RHD2[6]。RHD2與經(jīng)典兔瘟病理變化相似，雖然感染試驗顯示平均病死率只有20%左右，但是感染范圍更廣，包括一些野兔屬品種，可感染致死30日齡以內(nèi)的家兔和傳統(tǒng)兔瘟滅活苗免疫過的家兔[7-9]。

2020年5月初，四川省成都市某獺兔養(yǎng)殖場的獺兔1 200只(母兔300只商品兔和仔兔900只)，陸續(xù)出現(xiàn)不同生長階段獺兔包括母兔、商品兔和仔兔急性死亡病例，癥狀和病變與兔瘟相似。為確定病情，通過對送檢兔場兔群的發(fā)病情況調(diào)查、送檢病死兔只臨床剖檢和實驗室檢測與鑒別診斷進行確診，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例 四川省某獺兔養(yǎng)殖場送檢發(fā)病死亡獺兔9只，其中母兔1只，商品兔3只，仔兔5只。

1.1.2 試劑與菌株 DNA Marker DL 2 000、RNAiso Plus Kit，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；EVO M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑預混液試劑盒(AG11706)，艾科瑞生物有限公司產(chǎn)品；通用型基因組DNA提取試劑盒(9ZEL15)，構(gòu)菲特生物有限公司產(chǎn)品；2×TaqPCR Master Mix，成都飛克(天泰)科技有限公司產(chǎn)品；兔巴氏桿菌17株，四川農(nóng)業(yè)大學動檢實驗室保存。

1.1.3 引物 采用文獻[10-11]中RHDV、RHDV2和巴氏桿菌檢測引物(表1)，送往成都擎科生物工程有限公司合成，按照合成說明書將其稀釋至10 μmol/L,置-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

表1 實驗室診斷檢測引物

1.1.4 主要儀器 臺式冷凍離心機(Centrifuge 5418R)，德國艾本德(Eppendorf)公司產(chǎn)品；PCR儀(T100TM)和紫外凝膠成像系統(tǒng)(Universal HoodⅡ)，美國伯樂(Bio-Rad)公司產(chǎn)品；電泳儀(DYY-2C型)，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 流行病學調(diào)查 詢問了解兔場飼養(yǎng)管理、兔群發(fā)病情況及免疫用藥情況，發(fā)病臨床癥狀、死亡率等。

1.2.2 病理剖檢 按常規(guī)方法對送檢病死獺兔進行剖檢,觀察主要臟器的病理變化，并按無菌采取病料進行后續(xù)檢測和鑒別診斷。

1.2.3 RT-PCR檢測

1.2.3.1 RHDV和RHDV2的檢測 取采集肝、脾等病變組織混合采用RNAiso Plus Kit進行RNA提取，然后按照EVO M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑預混液試劑盒說明書操作進行反轉(zhuǎn)錄，反應體系為EVO M-MLV RT Master Mix 2 μL，RNA5 μL， ddH2O 3 μL；反應條件為37℃ 15 min， 85℃ 5 s。參照文獻[10]中反應體系和反應條件進行兔瘟病毒基因的檢測，同時做陽性對照(RHDV和RHDV2的靶片段重組質(zhì)粒為模板)和陰性對照(ddH2O為模板)。2×TaqPCR Master Mix 25μL， P1、P2、P3和P4 各1μL，cDNA 3μL，ddH2O 18 μL，混勻后按照以下程序進行擴增：95℃ 5 min；95℃ 40 s，56.5℃ 30 s，72℃ 30 s，35個循環(huán)；72℃ 10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物進行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.3.2 巴氏桿菌PCR檢測 取采集肝、脾等病變組織采用通用型基因組DNA提取試劑盒(9ZEL15)按照說明書進行DNA提取，然后參照文獻[12]反應體系和反應條件進行巴氏桿菌KMT1基因檢測，同時做陽性對照(兔巴氏桿菌17株為模板)和陰性對照(ddH2O為模板)。2×TaqPCR Master Mix 25 μL， P5和P6各1 μL，模板1 μL，ddH2O 22 μL，混勻后按照以下程序進行擴增：95℃ 5 min；95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 60 s，30個循環(huán)；72℃ 10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物進行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.3.3 PCR產(chǎn)物序列分析 將PCR陽性反應產(chǎn)物送成都有康生物技術(shù)公司進行序列測定，然后進行BLAST分析進行同源性比較。

2 結(jié)果

2.1 流行病學調(diào)查與臨床剖檢

兔場發(fā)病兔群陸續(xù)出現(xiàn)母兔、商品兔和乳兔急性死亡病例，母兔和商品兔死亡率15%左右，乳兔死亡率高達50%以上，嚴重者乳兔出現(xiàn)整窩死亡；兔場免疫過經(jīng)典兔瘟疫苗和巴氏桿菌疫苗，發(fā)病后抗生素治療無效。發(fā)病兔一般無明顯臨床癥狀突然死亡，死亡前呼吸困難，尖叫，抽搐，有的可見鼻孔出血(圖1A和圖1B)，一般情況下糞便干結(jié)(圖1C)，少數(shù)病例表現(xiàn)拉稀(圖1D)。

A、B.口鼻部位的異常變化；C、D.排除糞便的異常變化

剖檢病變與經(jīng)典兔瘟相似，主要以呼吸道出血病變和全身實質(zhì)性器官水腫和淤血、出血為特征變化。剖檢一般可見病死兔膀胱積尿(圖2A)；氣管環(huán)狀充血、出血(圖2B和圖2C)，個別有大量泡沫出現(xiàn)；肺臟點狀或片狀出血(圖2D)，嚴重者可見心肌出血(圖2E)；肝臟質(zhì)脆，淡黃色(圖2F)或瘀血呈紫紅色，嚴重者可見壞死灶(圖2G)；脾臟淤血腫大紫紅色(圖2H)；腎臟淤血腫大(圖2I)，嚴重者可見點狀出血(圖2J)。

2.2 實驗室診斷

對采集的心臟、肝、脾等病變組織混樣后提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后進行進行RHDV和RHDV2的PCR檢測，同時抽提樣品DNA進行巴氏桿菌的PCR檢測。檢測結(jié)果見圖3，RHDV和RHDV2鑒別RT-PCR陽性對照(泳道1)、陰性對照(泳道2)、與巴氏桿菌PCR檢測陽性對照(泳道4)、陰性對照(泳道5)均成立，檢測樣品的巴氏桿菌擴增陰性(泳道6)，僅有RHDV2擴增出約435 bp預期大小的特異性DNA條帶(泳道3)。

陽性PCR產(chǎn)物測序結(jié)果見圖4，經(jīng)BLAST分析顯示，擴增基因核苷酸序列與GenBank(登錄號MN061492)RHDV2(RHDV2-NL2016毒株)的核酸同源性最高為98.39%。最終確診送檢病兔為RHDV2感染。

圖4 RHDV2陽性RT-PCR產(chǎn)物測序結(jié)果

A.膀胱積尿；B、C.氣管充血、出血；D.肺臟出血；E.心肌出血；F、G.肝臟腫大質(zhì)脆；H.脾臟淤血腫大；I、J.腎臟瘀血、出血

2.3 處置與防控

確診后上報疫情，按照國家疫病防治技術(shù)的相關(guān)處理規(guī)范與要求，進行同群兔撲殺，并做無害化處理和消毒等處置。

M.DNA標準DL 2 000; 1.RHDV-RHDV2復合RT-PCR 陽性對照;2.RHDV-RHDV2復合RT-PCR 陰性對照；3.樣品RT-PCR產(chǎn)物；4.巴氏桿菌檢測陽性對照；5.巴氏桿菌檢測陰性對照；6.樣品PCR產(chǎn)物

3 討論

經(jīng)典兔瘟自1984年我國報道以后相繼在世界很多國家出現(xiàn)，也伴隨著陸續(xù)出現(xiàn)不同基因型和抗原型的RHDV變異株(RHDVa株)。2010年由法國首次報道發(fā)生RHD2，即出現(xiàn)了RHDV新變異毒株兔出血癥病毒2型(RHDV2)[6]。繼而，RHD2也呈現(xiàn)出向外蔓延趨勢，意大利、西班牙、德國、葡萄牙、英國、挪威等多數(shù)西歐國家和亞速爾群島，以及北非和南非一些國家陸續(xù)報道了該病的發(fā)生[10,13-14]。截止2020年5月底，美國和墨西哥均通報了RHD2疫情，尤其在美國，2019年7月出現(xiàn)RHD2疫情以來又已連續(xù)發(fā)生15起RHD2疫情，呈現(xiàn)出國內(nèi)擴散勢態(tài)[15]。2020年5月21日，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布了近日四川省金堂縣養(yǎng)兔場的RHD2疫情[16]，此前我國從未有過該病發(fā)生的報道。RHD2作為我國新發(fā)生動物疫病，目前我國除四川省外其他區(qū)域尚無該病的發(fā)生，加之該病國內(nèi)尚無商業(yè)化疫苗可以用，無有效預防措施，這應該引起人們的高度重視和關(guān)注。一方面要追溯發(fā)生RHD2疫情的原因，總結(jié)經(jīng)驗教訓，積極開展RHD2風險分析，加強檢疫，嚴防RHD2等外來病的傳入和RHD2疫情在國內(nèi)的蔓延；另一方面通過科研立項積極進行RHD2防控技術(shù)等方面的科技攻關(guān)。

本次病例診斷的報告從RHD2在送檢兔場成年兔和乳仔兔發(fā)病死亡情況，臨床癥狀、病理剖檢以及實驗室鑒別診斷的情況和方法進行了全面翔實的介紹，以期能為我國養(yǎng)兔場RHD2疑似病例的發(fā)現(xiàn)和診斷提供參考，進而做到RHD2的及早發(fā)現(xiàn)、及早診斷和有效控制蔓延。