解秀梅，童富珍

(1.青海畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，青海湟源 812100；2.佰匯緣寵物醫(yī)院，青海西寧 810001)

肺炎克雷伯菌屬于腸桿科中克雷伯菌屬一種革蘭氏陰性菌，根據(jù)生化特性可以分為肺炎亞種、鼻炎亞種和鼻硬結(jié)亞種，其中肺炎克雷伯菌亞種生存能力強(qiáng)，肺炎克雷伯菌廣泛分布于自然界中，主要存在于動(dòng)物及人的消化道、呼吸道、泌尿生殖道等[1-2]。肺炎克雷伯菌是人畜共患的條件性致病菌，可以引起人及多種動(dòng)物呼吸道、尿道感染和敗血癥等。近年來(lái)，關(guān)于動(dòng)物感染肺炎克雷伯菌的報(bào)道逐漸增多，且出現(xiàn)了高致病性、高水平多重耐藥肺炎克雷伯菌菌株，給養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)威脅公共衛(wèi)生安全及人類健康[3-4]。當(dāng)寵物犬感染肺炎克雷伯菌后，出現(xiàn)嚴(yán)重呼吸癥狀，尤其肺部的感染，嚴(yán)重的可以導(dǎo)致死亡[5]。人獸共患傳染病依舊是學(xué)者們的研究熱點(diǎn)，寵物犬作為人們的主要伴侶動(dòng)物，人獸共患細(xì)菌病可能對(duì)人存在一定潛在威脅，應(yīng)該引起注意[6]。

本研究從西寧地區(qū)寵物醫(yī)院采集患有呼吸道疾病寵物犬的咽拭子、鼻拭子和痰液等病料進(jìn)行肺炎克雷伯菌鑒定，并對(duì)其致病性、血清型及耐藥性進(jìn)行檢測(cè)，旨在為寵物犬肺炎克雷伯菌病防控及臨床指導(dǎo)用藥提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源 2019年1月至2020年6月，從西寧地區(qū)寵物醫(yī)院采集患有呼吸道疾病寵物犬的咽拭子、鼻拭子及痰液等樣本127份。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 22 g～25 g昆明系小鼠，由青海畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學(xué)院試驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)中心提供。

1.1.3 主要試劑 普通營(yíng)養(yǎng)肉湯、麥康凱肌醇阿東醇羧芐青霉素瓊脂(MIAC)、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；藥敏紙片，廣東環(huán)凱生物有限公司產(chǎn)品；陰性菌生化鑒定試條，威正翔禹生物科技有限公司產(chǎn)品；DNA Marker DL 2 000、2×TaqMarker Mix，康為世紀(jì)科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.4 主要儀器設(shè)備 多功能PCR儀，英國(guó)Techne公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad產(chǎn)品；電泳儀，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng) 采集患有呼吸道疾病寵物犬的咽拭子、鼻拭子和痰液等樣本，樣本經(jīng)過(guò)處理后，接種于普通營(yíng)養(yǎng)肉湯中增菌培養(yǎng)，37℃振蕩培養(yǎng)12 h～18 h后，接種于MIAC平板上，37℃培養(yǎng)12 h～18 h，挑MIAC平板的單個(gè)菌落接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中進(jìn)行純化培養(yǎng)后，進(jìn)行染色鏡檢顯微鏡觀察其形態(tài)學(xué)。

1.2.2 細(xì)菌生化試驗(yàn) 取出純化培養(yǎng)的分離菌株接種于陰性菌生化鑒定條中，37℃培養(yǎng)12 h～24 h，按照陰性菌生化鑒定試條說(shuō)明書進(jìn)行生化鑒定。

1.2.3 細(xì)菌的PCR鑒定 參照文獻(xiàn)[6]，根據(jù)GenBank中登錄的肺炎克雷伯菌khe基因序列 (CP035202.1)設(shè)計(jì)特異性鑒定引物P1:5′-ATGAAACGACCTGATTGCATTCGC-3′，P2:5′-TTACTTTTTCCGCGGCTTACCGTC-3′，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。用基因組DNA試劑盒提取分離菌株的DNA，用特異性引物進(jìn)行PCR檢測(cè)， 其PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行基因測(cè)序，其測(cè)序結(jié)果與GenBank中登錄序列用用BLAST軟件進(jìn)行同源性比對(duì)。同源性百分比≥99%，可以定義到種的水平；若同源性在97%～98.9%，可以定義到屬的水平；若<97%，則定義為科水平。

1.2.4 動(dòng)物攻毒試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[7-8]報(bào)道的方法， 將分離菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期計(jì)數(shù)，每株分離菌株每株分離菌株腹腔注射0.2 mL(108CFU/mL)，對(duì)照組注射等量的無(wú)菌的PBS，攻毒12 h后，觀察小鼠發(fā)病情況，試驗(yàn)期為7 d。對(duì)死亡的小鼠進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定。

1.2.5 細(xì)菌血清學(xué)鑒定 參考文獻(xiàn)[9-10]，設(shè)計(jì)肺炎克雷伯菌莢膜血清型(K1、K2、K3、K5、K20、K54和K57)引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成(表1)，用PCR方法對(duì)肺炎克雷伯菌進(jìn)行莢膜血清型檢測(cè)。

表1 莢膜血清型分型引物序列

1.2.6 藥敏試驗(yàn) 參照美國(guó)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)2019推薦的標(biāo)準(zhǔn)K-B紙片法進(jìn)行結(jié)果判斷，將分離菌株調(diào)整為0.5個(gè)麥?zhǔn)蠞岫?，均勻涂布在普通營(yíng)養(yǎng)平板生，貼上藥敏紙片，取平均值，分析其耐藥性。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果

采集的病料組織在肺炎克雷伯菌鑒別培養(yǎng)基MIAC上長(zhǎng)出了大小一致、邊緣整齊、半透明的桃紅色菌落，長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)菌落拉動(dòng)成絲(圖1)；在普通的營(yíng)養(yǎng)養(yǎng)基上長(zhǎng)出扁平的、圓形的、半透明菌落；通過(guò)革蘭氏染色，顯微鏡觀察其形態(tài)學(xué)，分離菌株在鏡下呈現(xiàn)為革蘭氏陰性的兩端鈍圓粗短桿菌狀(圖2)。

圖1 分離菌株菌落形態(tài)

圖2 分離菌株革蘭氏染色鏡檢形態(tài)(1 000×)

2.2 生化鑒定結(jié)果

分離菌通過(guò)生化鑒定結(jié)果顯示，鳥氨酸脫羧酶、接觸酶、尿素酶、L-阿拉伯醇、精氨酸雙水解酶均為陰性；甲基紅試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)均呈陽(yáng)性；不發(fā)酵D-麥芽糖、D-葡萄糖、D-纖維二糖、D-海藻糖、L-阿拉伯糖、D-甘露醇、D-山梨醇、L-鼠李糖等。其生化鑒定與肺炎克雷伯菌基本上一致，經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)，74株分離菌株初步鑒定為肺炎克雷伯菌。

2.3 PCR鑒定結(jié)果

將初步鑒定為肺炎克雷伯菌用PCR方法進(jìn)行進(jìn)一步鑒定，以上提取的分離菌株的基因組DNA為模板，用肺炎克雷伯菌khe基因特異性鑒定引物鑒定。結(jié)果顯示，初步鑒定為肺炎克雷伯菌的均擴(kuò)增出大約為489 bp的目的條帶(圖3)。測(cè)序結(jié)果顯示，74株肺炎克雷伯菌與GenBank中登錄肺炎克雷伯菌同源性均≥98.0%。

2.4 致病性檢測(cè)結(jié)果

昆明系小鼠在攻毒后的2 d～5 d，出現(xiàn)精神沉郁、采食量減少、呼吸困難，個(gè)別的小鼠出現(xiàn)急性死亡，剖檢死亡的小鼠肺部出現(xiàn)嚴(yán)重出血、出血、水腫；肝、脾出現(xiàn)不同程度的出血，且從死亡小鼠的肺部、肝臟中分離得到的肺炎克雷伯菌。未攻毒組的小鼠健康存活。62株肺炎克雷伯菌具有致病性。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1～4.分離菌株；5.空白對(duì)照M.DNA Marker DL 2 000;1-4.Isolated strains; 5.Blank control

2.5 血清型鑒定結(jié)果

用PCR法對(duì)62株致病性肺炎克雷伯菌進(jìn)行血清型(K1、K2、K3、K5、K20、K54、K57)檢測(cè)，結(jié)果顯示，K1血清型有18株(29.0%)、K2血清型有2株(3.2%)、K5血清型有23株(37.1%)，K20血清型有12株(19.4%)、K54血清型3株(4.8%)，未檢測(cè)出血清型有 4株(6.5%)。62株致病性肺炎克雷伯菌以K5、K1血清型為主要流行的血清型。

2.6 耐藥性分析結(jié)果

用K-B藥敏紙片法對(duì)62株致病性肺炎克雷伯菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)檢測(cè)，分析其耐藥性。結(jié)果由表2可知，62株致病性肺炎克雷伯菌對(duì)阿莫西林、氨芐西林、慶大霉素、新霉素、氟苯尼考、強(qiáng)力霉素、大觀霉素、磺胺二甲氧嘧啶8種藥物耐藥性較高，耐藥率在61.3%～100%之間；對(duì)頭孢噻呋、頭孢曲松、頭孢喹肟、左氧氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、林可霉素、磷霉素8種藥物耐藥率在9.7%～35.5%之間。

表2 分離菌株的耐藥性結(jié)果

3 討論

肺炎克雷伯菌最早是由Friedlander在大葉性肺炎患者的痰液中分離鑒定到，是醫(yī)院中獲得性肺炎的常見致病菌之一，尤其是泛耐藥肺炎克雷伯菌嚴(yán)重危害著ICU患者生命安全，成為臨床常見的主要致病性病原菌，嚴(yán)重威脅人們的健康[4-5]。肺炎克雷伯菌是重要的人畜共患條件病原菌，當(dāng)動(dòng)物機(jī)體抵抗力低下時(shí)，該菌在體內(nèi)適合的環(huán)境中大量繁殖并致病，發(fā)生其內(nèi)源性感染，引起嚴(yán)重的呼吸系統(tǒng)癥狀和敗血癥等，尤其對(duì)幼齡動(dòng)物其感染率和致死率均較高[11]。本研究從青海西寧地區(qū)采集的127份的患呼吸道癥狀的寵物犬樣品中分離得到62株致病性肺炎克雷伯菌，并用動(dòng)物試驗(yàn)證明其致病性，說(shuō)明該菌對(duì)寵物犬的危害較大，可能由于寵物患有犬瘟熱、冠狀病毒等病毒性疾病可以繼發(fā)肺炎克雷伯菌感染，引起呼吸道感染，當(dāng)寵物犬抵抗力下降時(shí)也會(huì)引起該病發(fā)生，因此，在寵物犬養(yǎng)殖過(guò)程中應(yīng)該引起重視，加強(qiáng)其寵物飼養(yǎng)管理。肺炎克雷伯菌含有多種血清型，常見以K抗原血清型為主，臨床中人和動(dòng)物的肺炎克雷伯菌主要為K1和K2較常見，也存在其他血清型[8-10]。本研究結(jié)果表明，分離的62株致病性肺炎克雷伯菌有4種血清型，以K5(37.1%)和K1(19.4%)血清型為主要流行的血清型。與張文舉等、楊延等報(bào)道有差異性，可能與地區(qū)有關(guān)，也與感染的宿主(狐貍、豬)等有關(guān)。

國(guó)內(nèi)相關(guān)研究表明，肺炎克雷伯菌對(duì)臨床中常用的藥物產(chǎn)生很強(qiáng)的耐藥性，并表現(xiàn)多重耐藥性，個(gè)別菌株β內(nèi)酰胺類和碳青霉烯類抗生素也產(chǎn)生耐藥性，給該病治療帶來(lái)了很大的困難[12]。任君等[5]報(bào)道了天津市某動(dòng)物醫(yī)院犬子宮蓄膿膿汁分離的肺炎克雷伯菌對(duì)氨芐西林、頭孢噻吩、麥迪霉素、哌拉西林耐藥。張聰?shù)萚6]報(bào)道了從南寧地區(qū)寵物醫(yī)院分離的伴侶動(dòng)物源肺炎克雷伯菌對(duì)臨床常用藥氨芐西林、哌拉西林、頭孢呋辛、四環(huán)素、多西環(huán)素、呋喃妥因、復(fù)方新諾明產(chǎn)生耐藥性。本研究結(jié)果表明，肺炎克雷伯菌對(duì)臨床中常用藥物產(chǎn)生很強(qiáng)耐藥性。在臨床中治療該病時(shí)應(yīng)該選擇敏感藥物進(jìn)行治療，交替使用抗菌藥物，提高治療效果，降低其耐藥率的增長(zhǎng)。