王丹丹，李 莉，楊艷歌，劉鳴暢，王洪越，吳淑清，袁 飛,*，吳亞君,*

（1.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100176；2.長(zhǎng)春大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130022）

克羅諾桿菌屬（Cronobacterspp.）是一種重要的食源性病原體，其存在于土壤、水以及人和動(dòng)物腸道中[1-3]。對(duì)于嬰兒，尤其是體質(zhì)量低于2 500 g的早產(chǎn)兒[4-5]，具有很高的感染風(fēng)險(xiǎn)?？肆_諾桿菌屬與新生兒腦膜炎病例、壞死性小腸結(jié)腸炎、敗血癥、血痢和腦膿腫相關(guān)[6-8]。有研究表明，克羅諾桿菌能在嬰兒奶粉中長(zhǎng)期存活[9]，因此對(duì)克羅諾桿菌屬的及時(shí)檢出是預(yù)防其危害發(fā)生的重要手段。

傳統(tǒng)微生物生理生化法檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，且檢測(cè)步驟繁瑣[10-11]，因此近年來眾多研究者對(duì)微生物快檢技術(shù)進(jìn)行了探索研究，目前市面上微生物快檢產(chǎn)品主要有即用型微生物快速檢測(cè)板[12]、顯色培養(yǎng)基[13-14]、ATP熒光檢測(cè)儀[15-17]、膠體金免疫層析試紙條[18-19]、進(jìn)口的微生物快速檢測(cè)系統(tǒng)等[20-22]。但是微生物測(cè)試片、快速檢測(cè)板、顯色培養(yǎng)基都需要進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的增菌過程[23-24]，因此檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，無(wú)法實(shí)現(xiàn)微生物快速檢測(cè)。ATP熒光檢測(cè)法對(duì)檢測(cè)樣品基質(zhì)要求較高，大多應(yīng)用于水質(zhì)檢測(cè)以及環(huán)境微生物的檢測(cè)，無(wú)法對(duì)食品等復(fù)雜基質(zhì)樣品進(jìn)行微生物檢測(cè)[25-26]。膠體金免疫層析試紙條其檢測(cè)限為106CFU/mL，檢測(cè)靈敏度較差[24,27]，導(dǎo)致其應(yīng)用受到限制。目前進(jìn)口的微生物快速檢測(cè)系統(tǒng)，雖然樣品前處理簡(jiǎn)單，但其設(shè)備成本較高，且也需要增菌過程，故檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)。

實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）技術(shù)是在普通PCR基礎(chǔ)上添加熒光染料或熒光探針[28]，通過PCR產(chǎn)物的積累，使得熒光信號(hào)增加[29-30]。相比于傳統(tǒng)PCR技術(shù)，real-time PCR技術(shù)能實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)對(duì)待檢成分進(jìn)行定性、定量分析，無(wú)需進(jìn)行電泳，節(jié)省了檢測(cè)時(shí)間[31-32]，目前被廣泛用于微生物的檢測(cè)研究。本研究建立集克羅諾桿菌屬一步法DNA提取和快速real-time PCR方法為一體的速測(cè)技術(shù)，通過方法優(yōu)化，整個(gè)檢測(cè)流程可在40 min內(nèi)完成。同時(shí)對(duì)建立的一步法DNA提取技術(shù)與傳統(tǒng)煮沸法進(jìn)行比較，顯示檢測(cè)靈敏度幾乎與傳統(tǒng)的煮沸法等同，該方法在不前增菌情況下對(duì)克羅諾桿菌的檢測(cè)靈敏度可達(dá)104CFU/mL，在短時(shí)間（8 h）前增菌的情況下靈敏度可達(dá)10 CFU/mL，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，以期為口岸食源性病源微生物現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)提供良好的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

嬰幼兒配方奶粉1段購(gòu)自北京某超市。丙二酸鹽陽(yáng)性克羅諾桿菌（DSM18702） 德國(guó)菌種細(xì)胞保藏中心；阪崎腸桿菌（ATCC29544） 美國(guó)菌種保藏中心；均貯存于中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院菌種庫(kù)。

胰蛋白胨大豆湯（tryptone soya broth，TSB）培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆瓊脂（tryptone soya ager，TSA）培養(yǎng)基英國(guó)Oxoid公司；PrepManTMUltra Sample preparation Reagent試劑盒 美國(guó)Thermo Fisher公司；DNA提取試劑盒 英國(guó)MicroGEM公司；2×TaqMan Fast qPCR Master MIX (Low Rox) BBI Life Sciences公司；QuantiNova Probe PCR Kit（100） 德國(guó)QIAGEN公司；Luna Universal Probe qPCR Master Mix美國(guó)BioLabs公司；GoldstarTaqMan Miture (Low Rox)和HyperProbe Mixture 北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；TaqMan Fast Advanced Master Mix、TaqManTMGene Expression Master Mix 美國(guó)Applied Biosystems公司；SsoAdvanced Universal Probes Supermix 美國(guó)Bio-Rad Laboratories公司。

1.2 儀器與設(shè)備

D2012 plus高速可調(diào)離心機(jī)、NANODROP 2000C紫外分光光度儀 美國(guó)Thermo Fisher公司；渦旋混合器 德國(guó)IKA公司；拍擊式均質(zhì)器 法國(guó)Interscience公司；高壓滅菌鍋 以色列Tuttnauer公司；DH-420電熱恒溫培養(yǎng)箱 美國(guó)Memmert公司；水浴鍋金壇市白塔新寶儀器廠；DNA PDQex核酸提取儀英國(guó)MicroGEM公司；迷你實(shí)時(shí)熒光PCR儀 杭州安塔生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株培養(yǎng)

將克羅諾桿菌屬進(jìn)行活化，接種于TSB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過夜[33]，然后將活化的菌落進(jìn)行保存，TSB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌液使用60%的甘油-20 ℃保存?zhèn)溆肹34]。

1.3.2 DNA提取

1.3.2.1 煮沸法

采用SN/T 1632.3—2013《出口奶粉中阪崎腸桿菌（克羅諾桿菌屬）檢驗(yàn)方法》第3部分：熒光PCR方法[35]，對(duì)奶粉中克羅諾桿菌屬的DNA進(jìn)行提取。取待測(cè)樣本增菌液1 mL置于1.5 mL離心管離心，再加入100 μL PrepMan Ultra提取液于離心管中，渦旋振蕩混勻30 s左右，然后100 ℃水浴10 min，12 000 r/min離心5 min，取上清液即為DNA模板，測(cè)其濃度后于-20 ℃保存[36]。

1.3.2.2 快提法

移取20 μL的對(duì)數(shù)期菌液到1.5 mL的離心管中，加入98 μL（ddH2O、10 μL 10×Green buffer、2 μL PrepGEM）的提取混合液混勻，將提取混合液和樣本加入PDQeX試管中，在MicroGEM DNA PDQex核酸提取儀上按照操作程序：75 ℃ 10 min、95 ℃ 2 min進(jìn)行溫控反應(yīng)，即可直接獲取DNA。

1.3.3 real-time PCR

根據(jù)SN/T 1632.3—2013第3部分：熒光PCR方法[35]合成引物探針，正向引物序列為5’-GGCGAGCGGCGAATATTAT-3’，反向引物序列為5’-CGGGTTTTCCCAGTTGAGATC-3’，探針序列為5’-FAM-CACCAGTTTTCGGTGCGCCAGC-BHQ-3’。real-time PCR體系：總體積25 μL包含12.5 μL real-time PCR預(yù)混液；10 μmol/L上下游引物各0.5 μL，10 μmol/L探針0.5 μL，模板DNA 5 μL，無(wú)菌ddH2O 6 μL。

1.3.4 快速real-time PCR程序優(yōu)化

為建立快速real-time PCR程序，傳統(tǒng)real-time PCR程序（50 ℃、2 min，95 ℃、10 min；95 ℃、15 s，55 ℃、1 min，40 個(gè)循環(huán)），在循環(huán)數(shù)不變的情況下，對(duì)各階段的反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化情況見表1。每個(gè)樣品平行檢測(cè)2 次，并進(jìn)行2 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

表1 快速real-time PCR程序Table 1 Fast real-time PCR reaction program

1.3.5 快速real-time PCR體系優(yōu)化

1.3.5.1 預(yù)混液的選取

分別選1～8號(hào)酶：2×TaqMan Fast qPCR Master MIX(Low Rox)、QuantiNova Probe PCR Kit、Luna Universal Probe qPCR Master Mix、HyperProbe Mixture、GoldstarTaqMan Miture(Low Rox)、TaqMan Fast Advanced Master Mix、TaqManTMGene Expression Master Mix、SsoAdvanced Universal Probes Supermix，進(jìn)行real-time PCR擴(kuò)增，比較其擴(kuò)增效率。每個(gè)反應(yīng)平行檢測(cè)2 次，并進(jìn)行2 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.5.2 預(yù)混液用量的優(yōu)化

目前快速real-time PCR預(yù)混液的用量為12.5 μL，考慮到實(shí)驗(yàn)成本，對(duì)預(yù)混液用量進(jìn)行優(yōu)化。預(yù)混液的用量依次為12.5、10、8、7、6、5 μL，保持反應(yīng)體系25 μL不變，預(yù)混液減少部分用ddH2O代替，進(jìn)行快速real-time PCR擴(kuò)增，選擇最適預(yù)混液的用量。每個(gè)反應(yīng)平行檢測(cè)2 次，并進(jìn)行2 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.5.3 探針用量的優(yōu)化

目前快速real-time PCR體系探針的用量為0.5 μL，考慮到實(shí)驗(yàn)成本，對(duì)探針用量進(jìn)行優(yōu)化。使體系探針用量依次為0.5、0.4、0.3、0.2、0.1 μL，保持反應(yīng)體系25 μL不變，酶減少部分用ddH2O代替，進(jìn)行快速real-time PCR擴(kuò)增，選擇最適探針用量。每個(gè)反應(yīng)平行檢測(cè)2 次，并進(jìn)行2 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.6 純菌液檢出限的確定

接種克羅諾桿菌屬于TSB培養(yǎng)基中，37 ℃過夜培養(yǎng)。使用平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)，10 倍梯度稀釋菌液。分別用煮沸法和快提法提取基因組DNA，并進(jìn)行快速realtime PCR擴(kuò)增。用ddH2O作空白對(duì)照，每個(gè)反應(yīng)平行檢測(cè)2 次，并進(jìn)行2 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.7 人工污染奶粉檢出限確定

在超凈工作臺(tái)中稱取25 g新開封的某品牌嬰幼兒配方奶粉1段于225 mL生理鹽水中，充分振蕩混勻配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的均質(zhì)液，即每1 g奶粉樣品相當(dāng)于10 mL均質(zhì)液。分別接種丙二酸鹽陽(yáng)性克羅諾桿菌和阪崎腸桿菌于TSB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)8 h。使用平板計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)菌體濃度，取1 mL菌液用滅菌生理鹽水進(jìn)行10 倍梯度稀釋，然后對(duì)勻漿液分別人工污染不同濃度的克羅諾桿菌屬菌液，制成人工污染樣品。取人工污染克羅諾桿菌屬的奶粉樣品提取模板DNA，進(jìn)行快速real-time PCR檢測(cè)，確定檢出限。用ddH2O作空白對(duì)照，每個(gè)反應(yīng)平行檢測(cè)2 次，并進(jìn)行2 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.8 檢測(cè)結(jié)果的判定

參考SN/T 1632.3—2013第3部分：熒光PCR方法[35]判斷其檢測(cè)結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及圖表繪制

從儀器導(dǎo)出2 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果和數(shù)據(jù)，并錄入在Excel表格中，在Excel中用“AVERAGE”計(jì)算平均值，選中“STDEV”計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差。根據(jù)數(shù)據(jù)繪制三線表、柱形圖或散點(diǎn)圖。為清晰展示結(jié)果，部分增加趨勢(shì)線，柱形圖用不同顏色和圖案填充；以重復(fù)實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差添加誤差線，部分用多個(gè)圖組合進(jìn)行結(jié)果呈現(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 快速real-time PCR程序的建立

以丙二酸鹽陽(yáng)性克羅諾桿菌和阪崎腸桿菌DNA為模板，對(duì)反應(yīng)程序進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如圖1所示。檢測(cè)時(shí)間從傳統(tǒng)的82 min左右縮短至27 min 15 s，縮短了1 h左右。real-time PCR擴(kuò)增效率顯示，阪崎腸桿菌檢測(cè)的Ct值僅從開始的17.34增加到18.29，丙二酸鹽陽(yáng)性克羅諾檢測(cè)Ct值從開始的16.35反而降低到14.82。2 種菌的擴(kuò)增變化均在1 個(gè)循環(huán)左右，表明建立的快速real-time PCR程序?qū)z測(cè)結(jié)果影響不大。

圖1 快速real-time PCR擴(kuò)增程序的優(yōu)化Fig. 1 Optimization of the fast real-time PCR amplification procedure

2.2 快速real-time PCR體系的優(yōu)化

2.2.1 預(yù)混液的優(yōu)化

為了篩選適用于快速real-time PCR檢測(cè)程序的預(yù)混液，選取市面上常見品牌的8 種酶，以丙二酸鹽陽(yáng)性克羅諾桿菌和阪崎腸桿菌DNA為模板，采用上述建立的快速real-time PCR程序?qū)? 種酶的擴(kuò)增效率進(jìn)行分析，擴(kuò)增結(jié)果分別如圖2A、B所示。并對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析（圖2C），結(jié)果顯示，6號(hào)酶對(duì)丙二酸鹽陽(yáng)性克羅諾桿菌的擴(kuò)增結(jié)果最好。而對(duì)于阪崎腸桿菌，1號(hào)酶和6號(hào)酶對(duì)阪崎腸桿菌的擴(kuò)增效果均較好，平均Ct值分別為17.77±0.81和18.06±0.91，結(jié)果相差不大。綜合2 種菌的檢測(cè)結(jié)果，選定6號(hào)酶即TaqMan Fast Advanced Master Mix作為快速real-time PCR檢測(cè)的預(yù)混液。

圖28 種real-time PCR預(yù)混液擴(kuò)增結(jié)果分析Fig. 2 Analysis of amplification results with eight real-time PCR premixes

2.2.2 反應(yīng)體系優(yōu)化

影響real-time PCR檢測(cè)費(fèi)用的2 個(gè)主要因素是realtime PCR預(yù)混液和探針，因此為降低實(shí)驗(yàn)成本，對(duì)其進(jìn)行體系優(yōu)化。首先對(duì)預(yù)混液用量進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果（圖3A）顯示預(yù)混液用量為7 μL時(shí)與標(biāo)準(zhǔn)體系的擴(kuò)增結(jié)果相差不大，而當(dāng)預(yù)混液用量為6 μL時(shí)擴(kuò)增效率顯著降低。因此在保證檢測(cè)結(jié)果的前提下，為降低實(shí)驗(yàn)成本，推薦預(yù)混液的用量為7 μL。

進(jìn)一步對(duì)探針的用量進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如圖3B所示，探針用量從0.5 μL降到0.2 μL時(shí)擴(kuò)增結(jié)果影響不大，因此推薦探針用量為0.2 μL。

圖3 反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果Fig. 3 Optimal conditions of the reaction system

2.3 快提法與傳統(tǒng)煮沸法結(jié)果比較

為了快速高效地獲取克羅諾桿菌的DNA，本研究通過比較后采用MicroGEM DNA提取試劑盒提取克羅諾桿菌的DNA，該方法可在直接挑取菌落或取菌液后僅通過溫控反應(yīng)一步法獲取DNA。為了分析其檢測(cè)效率，將快提法與傳統(tǒng)煮沸法進(jìn)行比較。通過平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)測(cè)定丙二酸鹽陽(yáng)性克羅諾桿菌、阪崎腸桿菌原菌液初始濃度均為108CFU/mL，進(jìn)行10 倍梯度稀釋后，其濃度分別為107、106、105、104、103、102、101、100CFU/mL，分別通過快提法和煮沸法提取2 種菌的DNA，并用快速real-time PCR進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，分別如圖4和圖5所示。

圖4 丙二酸鹽陽(yáng)性克羅諾桿菌檢測(cè)結(jié)果Fig. 4 Results of Cronobacter malonaticus detection

圖5 阪崎腸桿菌檢測(cè)結(jié)果Fig. 5 Results of Enterobacter sakazakii detection

結(jié)果（圖4）顯示，快提法和煮沸法對(duì)丙二酸鹽陽(yáng)性克羅諾桿菌純菌的檢測(cè)靈敏度均為104CFU/mL，人工污染樣品培養(yǎng)1、2、3 h的靈敏度為104CFU/mL，培養(yǎng)4 h的靈敏度為103CFU/mL，培養(yǎng)5、6 h的靈敏度都為102CFU/mL，培養(yǎng)7 h快提法的靈敏度為102CFU/mL，煮沸法的靈敏度為101CFU/mL，培養(yǎng)8 h快提法的靈敏度為101CFU/mL，比煮沸法靈敏度低1 個(gè)數(shù)量級(jí)。

阪崎腸桿菌快提法和煮沸法檢測(cè)結(jié)果（圖5）顯示，快提法和煮沸法對(duì)純菌的檢測(cè)靈敏度都為104CFU/mL，快提法對(duì)人工污染樣品培養(yǎng)前5 h的靈敏度為104CFU/mL，煮沸法在培養(yǎng)0 h時(shí)檢測(cè)靈敏度為105CFU/mL，培養(yǎng)到5 h之前靈敏度為104CFU/mL，培養(yǎng)6 h的靈敏度均為103CFU/mL，培養(yǎng)7 h靈敏度均為102CFU/mL，培養(yǎng)8 h快提法的靈敏度為101CFU/mL，而僅比取樣量超出50 倍的煮沸法的靈敏度低1 個(gè)數(shù)量級(jí)。以上檢驗(yàn)結(jié)果表明建立的一步法DNA提取技術(shù)檢測(cè)的靈敏度幾乎與傳統(tǒng)的煮沸法等同，可以滿足現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)快速便捷的檢測(cè)需求。

3 討論與結(jié)論

丙二酸鹽陽(yáng)性克羅諾桿菌和阪崎腸桿菌的快提法與傳統(tǒng)煮沸法檢驗(yàn)結(jié)果表明，2 種方法對(duì)純菌的檢測(cè)以及人工污染樣品培養(yǎng)前6 h可以達(dá)到同樣的靈敏度，到7、8 h時(shí)，快提法的檢出限較傳統(tǒng)煮沸法低1 個(gè)數(shù)量級(jí)，分析可能是2 種方法取樣量差異造成的，煮沸法取樣量是快提法取樣量的50 倍，導(dǎo)致2 種方法在檢測(cè)結(jié)果上稍有偏差。雖然煮沸法靈敏度稍高于快提法，但是傳統(tǒng)煮沸法需要離心、煮沸、再離心、去脂肪及蛋白質(zhì)等步驟，整個(gè)過程需要30 min左右。而本研究建立的一步法快速提取DNA是通過使用降解能力遠(yuǎn)高于蛋白酶K的嗜熱蛋白酶，提取流程僅通過取樣-加液-溫控反應(yīng)即可完成DNA提取。這樣避免了傳統(tǒng)煮沸法的離心、沸水浴等過程，也避免了傳統(tǒng)磁珠法/吸附柱法中吸附、洗脫、洗滌等環(huán)節(jié)反復(fù)移液操作造成的損失，在快速提取的同時(shí)保證了DNA的高收率?？稍?2 min左右獲取目標(biāo)菌株DNA，極大簡(jiǎn)化了提取步驟，提高了DNA提取效率。

目前微生物快檢技術(shù)主要研究方向包括分子生物學(xué)技術(shù)、傳感器技術(shù)以及光譜技術(shù)。其中分子生物學(xué)技術(shù)除了本實(shí)驗(yàn)涉及的real-time PCR技術(shù)外，應(yīng)用較多的還有環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)在未增菌的情況下，其對(duì)微生物的檢出限達(dá)到103CFU/mL[37]。該技術(shù)雖然較realtime PCR技術(shù)對(duì)儀器的要求更低，但該技術(shù)需引入多條引物，對(duì)引物要求較高[36]。傳感器技術(shù)主要包括光學(xué)生物傳感器、電化學(xué)生物傳感器以及機(jī)械生物傳感器，對(duì)微生物的檢出限也可達(dá)到103CFU/mL[36,38-40]。該技術(shù)檢測(cè)微生物具有快速、靈敏、操作簡(jiǎn)單、對(duì)操作人員要求低等特點(diǎn)，但食物基質(zhì)的復(fù)雜性限制了生物傳感器的靈敏度和特異性，生物傳感器用于識(shí)別生物分子的原件其壽命相對(duì)較短，且生產(chǎn)成本也比較高，所以生物傳感器技術(shù)的使用受到了一定的限制，大多還處于研制階段[41-42]。拉曼光譜及表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)是目前應(yīng)用較多的檢測(cè)微生物的光譜技術(shù)，拉曼光譜技術(shù)對(duì)微生物的檢出限為103CFU/mL[43]，而表面增強(qiáng)拉曼光譜的檢出限可達(dá)100CFU/mL[44]。該技術(shù)檢測(cè)微生物具有預(yù)處理步驟簡(jiǎn)單、對(duì)菌體無(wú)損傷等優(yōu)點(diǎn)，但其圖像易受生長(zhǎng)環(huán)境、生長(zhǎng)狀態(tài)以及標(biāo)本制作過程等因素的影響，且其檢測(cè)的波長(zhǎng)，樣品處理方式都不統(tǒng)一，因此還需要不斷發(fā)展以更好的應(yīng)用在微生物檢測(cè)領(lǐng)域[45]。本實(shí)驗(yàn)建立的快速檢測(cè)技術(shù)基于基因進(jìn)行檢測(cè)，受食物基質(zhì)影響較小，且操作步驟快速簡(jiǎn)單、靈敏度高，結(jié)果也不需要進(jìn)行電泳等步驟，具有很好的應(yīng)用前景。

通過調(diào)查，發(fā)現(xiàn)市面上微生物的快速檢測(cè)設(shè)備較少，且基本都需要長(zhǎng)時(shí)間的前增菌培養(yǎng)，例如，目前應(yīng)用較多的微生物快速檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)10 CFU/mL的菌至少需要培養(yǎng)16 h[20-22]，而本研究建立的速測(cè)技術(shù)，僅培養(yǎng)8 h即可達(dá)到上述檢出限，且從DNA提取到快速real-time PCR檢測(cè)僅需40 min即可完成。同時(shí)該方法在不前增菌的情況下對(duì)克羅諾桿菌屬檢測(cè)的靈敏度可達(dá)104CFU/mL，而微生物快速檢測(cè)系統(tǒng)要達(dá)到相同檢測(cè)靈敏度，至少需要培養(yǎng)8 h，因此本研究建立的速測(cè)技術(shù)具有明顯的優(yōu)勢(shì)。然而目前該方法也存在一些技術(shù)問題，主要是由于DNA提取管的容量小（100 μL）導(dǎo)致取樣量太少，影響了檢測(cè)的靈敏度。后期將通過加大提取管的容量，或使用濾膜、免疫磁珠等方式富集菌體提高取樣量，從而提高檢測(cè)的靈敏度。另外本實(shí)驗(yàn)所用迷你real-time PCR儀升降溫速率快，可達(dá)10 ℃/s，使整個(gè)變溫?cái)U(kuò)增過程所需要的時(shí)間大大減少；僅A4紙大小，方便攜帶；且具有固定、無(wú)運(yùn)動(dòng)的光學(xué)部件，長(zhǎng)期使用或移動(dòng)運(yùn)輸無(wú)需高昂繁瑣的定期校準(zhǔn)維護(hù)。因此本研究后期將通過組合一步法快速提取DNA技術(shù)配套迷你real-time PCR儀，形成一個(gè)便攜式微生物快速檢測(cè)集裝箱，為小空間、口岸、現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)等場(chǎng)景的應(yīng)用提供良好的技術(shù)支撐。