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        基于液相色譜-四極桿飛行時間質譜方法分析冰鮮雞肉代謝標志物

        2021-08-31 02:34:56王珂雯徐貞貞楊曙明
        食品科學 2021年16期
        關鍵詞:冰鮮代謝物雞肉

        王珂雯,徐 雷,徐貞貞,王 雪,楊曙明

        (1.中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質量標準與檢測技術研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質量安全重點實驗室,北京 100081;2.中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院,北京 100083)

        國家統(tǒng)計局數(shù)據(jù)顯示,2019年我國肉類產(chǎn)量達7 758.78萬 t,居世界第一,其中禽肉占比達29%,是我國第二大肉類產(chǎn)品。目前我國雞肉總產(chǎn)量為1 260萬 t,其中,黃羽肉雞消費量已達雞肉總消費量的40%,且其產(chǎn)量還在持續(xù)上漲,是我國禽類產(chǎn)業(yè)高質量發(fā)展的增長點之一[1]。另一方面,自禽流感爆發(fā)以來,活禽交易在我國各地相繼被禁止[2],目前禽類產(chǎn)品多以“白條雞”形式上市[3]。在產(chǎn)業(yè)轉型和政府施策的背景下,市售雞肉,特別是黃羽肉雞多以冰鮮雞和冷凍雞為主要銷售形式。禽類產(chǎn)業(yè)開始實施“集中屠宰、冷鏈配送、生鮮上市”的模式[2],使消費者對冰鮮雞的接受程度逐漸增強[4]。

        冰鮮雞肉指屠宰后貯存溫度保持在-3~4 ℃的雞肉,冷凍雞肉指一直以-18 ℃或更低溫度貯存的雞肉[5]。與冷凍雞肉相比,冰鮮雞肉無需冷凍,避免了冰晶的形成和再結晶[6],減少了冰晶對雞肉微觀結構造成的物理破壞,保留雞肉的感官和營養(yǎng)品質[7]。然而,冰鮮雞肉在低溫貯存中,容易發(fā)生微生物腐敗[8],不利于雞肉的感官和安全品質[9]。此外,由于檢測技術的局限,針對同一物種的隱蔽性摻假行為研究較少[10]。因此,需要對冰鮮雞代謝物進行全面且深入的研究,了解冰鮮雞品質變化特征以及冰鮮雞肉與鮮雞肉的代謝物差異,實現(xiàn)冰鮮雞市場的順利拓展,調動市場積極性,達到保障食品安全與品質的雙重目標。

        冰鮮雞肉的代謝和品質變化是一個非常復雜的過程,目前對該問題的研究主要集中在分析與代謝相關的物理化學指標上。巨曉軍等[11]使用pH值、失水率、嫩度、肉色值、肌苷酸等指標,對不同貯存時間的冰鮮雞肉與鮮雞肉進行比較,發(fā)現(xiàn)冰鮮雞肉貯存6 d之內品質變化較小。王虎虎等[12]使用氣相色譜和液相色譜對冰鮮雞肉與鮮雞肉中的核苷酸、氨基酸、還原糖等物質進行定量測定。相比于這些方法,代謝組學可全面分析有機組織和生物液體中低分子質量代謝物[10],實現(xiàn)監(jiān)測肉類代謝物的動態(tài)變化[13],降低遺漏重要代謝物的可能,操作更為簡便。一般來說,在生物體代謝過程中,含量變化具有一定規(guī)律的物質更能反映生物體的代謝過程,因此,代謝組學關注的是差異物。進一步,當這些代謝差異物含量變化可以解釋機體的某些生理生化過程時,代謝差異物可以作為代謝標志物進行后續(xù)分析。比如,在牛肉腌制過程中,氨基酸、糖、醋酸、琥珀酸、尿嘧啶和肌苷含量升高,乳酸、肌酸、肌苷-5-磷酸和鵝肌肽含量降低,這些代謝差異物含量的變化與腌制牛肉風味的形成存在相關性,可以作為牛肉腌制過程中的代謝標志物[14]。

        在對龐大的代謝組學數(shù)據(jù)進行挖掘和篩選時,最常用的多元統(tǒng)計分析模型為主成分分析(principal component analysis,PCA)。Xu Lei等[15]采用PCA對3 種制作方式的咖啡代謝物數(shù)據(jù)進行分析,PC1的貢獻率為31.6%,PC2的貢獻率為19.8%。Balog等[16]采用三維PCA對3 種烹飪方式獲得的牛肉代謝物數(shù)據(jù)進行分析。與PCA不同,正交偏最小二乘(orthogonal partial least square,OPLS)法是一種回歸模型,可以利用有限的變量獲取代謝物與響應變量之間的相關性[17-18],目前該模型的使用較少,僅有的研究將其應用于微生物[19-20]和唾液代謝物分析[21]。本研究首次在雞肉代謝物分析中使用OPLS模型,以探究OPLS模型鑒別不同貯存時間冰鮮雞肉和鮮雞肉的可行性。

        本實驗中,研究對象為北京油雞,屬于肉蛋兼用型黃羽肉雞,國家級畜禽遺傳資源的保護雞種,近年來已在華北、東北等地推廣養(yǎng)殖與銷售[22]。Zhao Guiping等[23]研究表明,從肉質性狀、肌纖維特征、營養(yǎng)成分和含量等角度來說,北京油雞與AA白羽肉雞相比,具有明顯的優(yōu)勢。目前,國內外對北京油雞的研究多集中于肌肉品質性狀相關的遺傳分子標記、篩選及飼養(yǎng)、日齡等對油雞肉品質的影響等[24-27],而關于其冰鮮雞肉和鮮雞肉的代謝物研究較少?;诖耍狙芯坎捎靡合嗌V-四極桿飛行時間質譜(liquid chromatography-quadruple time-offlight mass spectrometry,LC-QTOFMS)技術對不同貯存時間的北京油雞冰鮮雞肉(1、3、5、7、10 d)和北京油雞鮮雞肉(0 d)進行非靶向代謝組學分析,將OPLS模型應用于雞肉代謝組學分析中,篩選出潛在標志物,尋找冰鮮雞肉和鮮雞肉在代謝物組成上的差異與相似性。本研究旨在為冰鮮雞肉的代謝物研究提供思路,為冰鮮雞肉的貯存提供數(shù)據(jù)支撐。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        北京油雞公雞樣本來自北京百年栗園生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司密云區(qū)百年栗園養(yǎng)殖基地。所有樣本來自同一養(yǎng)殖區(qū)域,樣本散養(yǎng)日齡為120~150 d,平均體質量為1.5 kg。當日屠宰的雞肉及時預冷至4 ℃,達到冰鮮要求,在無菌狀態(tài)下冷鏈運輸,3 h內轉移到實驗室,進行后續(xù)貯藏期實驗。

        甲酸、甲醇(均為色譜純) 北京迪馬科技有限公司;乙腈(色譜純) 美國Thermo Fisher Scientific公司;超純水由Milli-Q一體化水凈化系統(tǒng)制備。

        1.2 儀器與設備

        TripleTOF 6600超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜儀美國AB SCIEX公司;Milli-Q Advantage A10純水系統(tǒng)德國Merck Millipore公司;SK8200LHC超聲波清洗器上??茖С晝x有限公司;08F107-42天平 武漢艾德姆衡器有限公司;3K15高速冷凍離心機 德國Sigma公司。

        1.3 方法

        1.3.1 雞肉樣品制備

        真空包裝的公雞樣本運輸?shù)竭_實驗室后,取雞胸肉組織,混合均勻,使用食品級自封袋分裝,貯存在4 ℃。屠宰當天的雞肉為第0天的樣本,記錄為鮮雞肉,其余雞肉在4 ℃條件下貯存1、3、5、7、10 d,記錄為不同貯存時間的冰鮮雞肉,每天的雞肉樣品進行5 個生物學重復。貯存一定時間后,取出雞胸肉樣品,勻漿,準確稱取100 mg樣品,進行提取操作。樣本提取程序參考Sidwick等[10]的研究。向樣品中加入50%甲醇溶液1 mL,超聲提取10 min,16 100×g離心20 min。上清液作為水提液保留,剩余不溶組織進行進一步提取。按照每100 mg剩余不溶組織加入1 mL二氯甲烷-甲醇(3∶1,V/V)的比例加入提取液,用干凈的吸管對不溶組織顆粒進行破碎,并對不溶組織顆粒超聲處理10 min,16 100×g離心20 min。2 次提取得到的上清液轉移至玻璃瓶中,于通風櫥中蒸發(fā)過夜。蒸發(fā)后的樣品在甲醇中重懸到相同體積,使用0.22 μm有機系濾膜過濾后上機。

        1.3.2 質量控制樣品制備

        在分析過程中,質量控制(quality control,QC)樣品是對每個樣品等量取樣并均勻混合得到的樣品[28],用于檢測分析的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性[10]。QC樣品的制備參考Wilson等的研究[29]。按照1.3.1節(jié)方法獲得各個樣品的提取液,等量取樣,均勻混合,得到的樣品記為QC樣品。為了確?;€的穩(wěn)定性,在實驗開始時使用大量的QC樣品上機進樣。對雞肉樣品分析時,每分析5 個樣品,使用QC樣品上機進樣1 次,確保檢測分析過程的穩(wěn)定性和可重復性。在整個分析過程中,從QC樣品上標記峰面積計算出變異系數(shù),以監(jiān)測數(shù)據(jù)的精確度。變異系數(shù)超過20%的QC樣品需要去除[30]。

        1.3.3 色譜和質譜條件

        色譜條件:Ec lipse Plus?C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)。進樣量3 μL,流速0.3 mL/min,柱溫40 ℃。流動相A為0.1%甲酸,流動相B為3 mmol/L乙腈溶液含0.1%甲酸。正離子模式下洗脫梯度:0~1 min,95%~47.5% A,5%~52.5% B;1~22 min,48%~0% A,52%~100% B;22~27 min,0% A,100% B;27~27.1 min,0%~95% A,100%~5% B;27.1~30 min,95% A,5% B。負離子模式下洗脫梯度:0~1 min,95%~40% A,5%~60% B;1~10 min,40%~35% A,60%~65% B;10~12 min,35%~20% A,65%~80% B;12~15 min,20%~0% A,80%~100% B;15~22 min,0% A,100% B;22~22.1 min,0%~95% A,100%~5% B。

        質譜條件:電噴霧離子源;質量掃描范圍m/z50~1 000。正離子掃描方式:離子源溫度550 ℃,噴霧電壓5 500 V,霧化氣壓力50 psi,輔助加熱氣壓力50 psi,氣簾氣壓力25 psi,去簇電壓80 V,離子碰撞能量10 eV。負離子掃描方式:離子源溫度550 ℃,噴霧電壓-4 500 V,霧化氣壓力50 psi,輔助加熱氣壓力50 psi,氣簾氣壓力30 psi,去簇電壓-80 V,離子碰撞能量-10 eV。

        1.3.4 數(shù)據(jù)采集和預處理

        使用PeakView 2.2軟件對數(shù)據(jù)進行采集和預處理,包括數(shù)據(jù)挖掘、峰校準和篩選。數(shù)據(jù)挖掘的范圍m/z50~1 000,保留時間0.5~22 min;峰校準和篩選:質量數(shù)偏差為10×10-6,保留時間偏差0.5 min,對強度大于100的峰進行篩選。

        1.3.5 非靶向代謝物鑒定及數(shù)據(jù)可視化

        數(shù)據(jù)預處理后將峰度信息導入到SIMCA-P 14.1(瑞典Umetrics公司)軟件中進行OPLS分析,采用交叉驗證方差分析(cross validation-analysis of variance,CVANOVA)對該模型的可靠性進行驗證,確認模型的可靠性后,根據(jù)變異權重參數(shù)值(variable importance in projection,VIP)大于1,相關性系數(shù)絕對值大于0.40,以及P值小于0.05 篩選出潛在標志物。利用MetaboAnalyst(https://www.metaboanalyst.ca)繪制潛在標志物熱圖,并對熱圖數(shù)據(jù)進行分層聚類分析。將差異物導入Peakview軟件,利用“Formula Finder”確定分子式,理論和實際的質量偏差小于5×10-6,同位素分布在理論分布范圍的20%以內,得到潛在標志物的二級信息,將其導入Massbank數(shù)據(jù)庫(http://www.massbank.jp),得到潛在標志物的二級信息,使用Origin 2018(Microcal Software, Inc., MA,USA)軟件將實驗和數(shù)據(jù)庫中的二級質譜信息繪制于鏡像圖中,對潛在標志物進行驗證。

        2 結果與分析

        2.1 QC樣品分析

        經(jīng)過所有QC樣品比對,LC-QTOF MS的總離子色譜圖在正離子模式下共提取到370 個化合物峰,在負離子模式下提取276 個化合物峰。如圖1所示,不同顏色表示不同的QC樣品。不同QC樣品峰的重疊程度大則表明檢測系統(tǒng)較好的穩(wěn)定性,實驗數(shù)據(jù)也更加可靠,因此,圖1B表明負離子模式采集的數(shù)據(jù)更加可靠。

        圖1 QC樣品的總離子色譜圖Fig. 1 Total ion current chromatograms of QC samples

        2.2 OPLS模型分析

        不同貯存時間的冰鮮雞肉和鮮雞肉樣品上機檢測,得到代謝物的峰度信息,將數(shù)據(jù)預處理后導入SIMCA-P 14.1,在正負離子模式下分別進行OPLS模型擬合,以代謝物水平與貯存時間作為響應變量。采用CV-ANOVA對模型進行驗證,2 種模式下的模型均滿足P值小于0.001,表明OPLS模型具有可靠性,可以進行后續(xù)分析[31]。圖2表明,在負離子模式下,同一天的雞肉樣品可以更好地被歸為同一組,6 d的樣品被分為6 組。在正離子模式下,OPLS模型的R2和Q2為0.94和0.79,負離子模式R2和Q2為0.99和0.80。理論上講,R2和Q2的值越接近1說明模型越可靠[32]。因此,負離子模式下的OPLS模型具有更好的預測性,且結合2.1節(jié)結果,負離子模式下的QC樣品峰重疊程度更大,表明負離子模式下檢測系統(tǒng)具有較好的穩(wěn)定性,實驗數(shù)據(jù)更加可靠,因此,后續(xù)分析基于負離子模式下采集的數(shù)據(jù)。

        圖2 雞肉樣品的OPLS得分圖和Y預測值圖Fig. 2 OPLS scores and predicted Y values of chicken samples

        2.3 代謝物篩選

        在負離子模式下,以VIP值大于1、相關性系數(shù)絕對值大于0.40和P值小于0.05作為篩選條件,篩選出29 個差異物。使用MetaboAnalyst軟件對29 個差異物繪制熱圖,并對熱圖進行分層聚類分析,得到圖3?;衔镌诓煌u肉樣品中的濃度用熱圖顏色表示。圖3為潛在標志物的變化趨勢,從中可以直觀看出差異物在不同雞肉樣品中的變化。

        圖3 負離子模式下不同雞肉樣品中化合物含量變化的趨勢圖Fig. 3 Trends in compound contents in different chicken samples in negetive ion mode

        根據(jù)對不同雞肉樣品的分層聚類結果,30 個雞肉樣品主要分為3 類(圖4)。第1類由鮮雞肉的5 個樣品組成,第2類主要由貯存1、3 d和5 d的冰鮮雞肉樣品組成,第3類主要由貯存7 d和10 d的冰鮮雞肉組成,表明從代謝物角度來說,貯存5 d以內的冰鮮雞肉與鮮雞肉具有更大的相似性,隨著貯存時間的延長,冰鮮雞肉與鮮雞肉代謝物差異逐漸增加。根據(jù)對不同化合物的分層聚類分析,發(fā)現(xiàn)這些代謝物可以分為2 類,其中第1類化合物主要表現(xiàn)為在貯存過程含量逐漸降低,而第2類化合物主要表現(xiàn)為在貯存過程中含量逐漸增多。

        圖4 負離子模式下不同雞肉樣品中29 個潛在標志物的分層聚類分析熱圖Fig. 4 Heatmap from hierarchical clustering analysis of 29 potential metabolite markers from chicken samples in negative mode

        2.4 差異物鑒定及分析

        將29 個差異物的信息導入Peakview軟件,利用“Formula Finder”確定分子式,理論和實際的質量偏差小于5×10-6,同位素分布在理論分布范圍的20%以內。從中得到的物質二級信息導入Massbank數(shù)據(jù)庫,進行分子結構確定,得到潛在標志物的分子式(表1),這些標志物主要包括氨基酸、多肽、脂肪酸和核苷酸等。上述標志物與Massbank數(shù)據(jù)庫中檢索到的二級質譜圖進行匹配驗證,得到潛在標志物的質譜信息鏡像圖(圖5)。

        圖5 不同雞肉樣品潛在標志物的質譜鏡像圖Fig. 5 Mirror plots of tandem mass spectra of potential metabolites markers in different chicken samples

        表1 潛在標志物的分子式Table 1 Basic information about potential metabolite markers

        內源性以及微生物中的蛋白酶和脂肪酶的水解作用,是造成肉類和肉制品品質變化的重要原因[33-34]。因此,肉制品貯存過程中氨基酸、肽和脂肪酸含量的變化可以反映肉制品的代謝過程以及相關生理生化反應。動物體內約2/3的色氨酸來源于組織蛋白分解的內源性色氨酸[35],其與苯丙氨酸等8 種氨基酸稱為必需氨基酸[36]。與肉類風味相關的游離氨基酸,如色氨酸和苯丙氨酸,可以反映肉類品質[37]。隨著貯存時間的延長,雞肉中的色氨酸(95號)和苯丙氨酸(72號)含量增加,可能是雞肉中的蛋白質逐漸被蛋白酶和微生物水解產(chǎn)生小分子氨基酸[38]。圖6A和圖6B表明,色氨酸和苯丙氨酸含量在0~5 d的雞肉樣品中無顯著差異,貯存7 d后,兩物質含量均顯著升高,表明鮮雞肉和貯存5 d內的冰鮮雞肉蛋白質降解反應幾乎沒有發(fā)生,貯存5 d后,降解反應顯著增加,不利于冰鮮雞肉的感官品質。Wen Dongling[39]和王虎虎[12]等的研究與本實驗結果相似。

        鵝肌肽為肌肽的甲基化衍生物,兩者為組氨酸二肽,具有顯著的抗氧化作用,是肉類的內源性抗氧化劑,已被證明可以保護肉類免受氧化性品質惡化[40],并且有利于形成肉類良好的風味和細嫩的質地[41]。Sundekilde等[42]的研究表明,在營養(yǎng)不良的雞中,雞肉肌肽和鵝肌肽含量均顯著降低。因此,肌肽和鵝肌肽對雞肉品質有重要意義。圖6C和圖6D表明,隨著貯存時間的延長,肌肽(107號)和鵝肌肽(112號)含量有所下降,肌肽在貯存1 d后含量顯著下降,鵝肌肽在貯存7 d后含量顯著下降,說明2 個物質在雞肉貯存中發(fā)揮抗氧化作用的時間階段不同,肌肽主要在貯存前期被消耗,一段時間后,鵝肌肽才開始發(fā)揮抗氧化作用被消耗,這2 種物質的減少不利于雞肉風味和質地的保持。

        棕櫚酸屬于中長鏈飽和脂肪酸,在雞肉中含量較高,相對含量約為25%[43]。圖6E表明,與鮮雞肉相比,棕櫚酸(119號)含量在第3天顯著增加,并在3 d后呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢,與王虎虎等[12]的結果一致。甘油三酯在酸性和堿性或脂肪酶活躍的條件下,容易分解為脂肪酸和甘油,而雞肉貯存過程中,隨著蛋白質的降解和其他代謝物含量的變化,造成體系酸堿度的改變,促進油脂降解生成脂肪酸,最終表現(xiàn)為棕櫚酸含量的顯著增加。此外,色氨酸的存在可能會促進甘油三酯的降解[44]。

        二十碳五烯酸又稱花生五烯酸,屬于ω-3脂肪酸,是人體的必需脂肪酸,可以降低心腦血管疾病風險[45]。一般來說,雞肉中不飽和脂肪酸含量高于飽和脂肪酸含量,其中二十碳五烯酸的相對含量約為25%[43]。Stanton等[46]的研究表明,有規(guī)律地攝入二十碳五烯酸豐富的雞肉有助于人體血漿多不飽和脂肪酸的升高,在一定程度上可以代替部分魚類和營養(yǎng)補充劑。雞肉中二十碳五烯酸含量與飼料相關,研究表明,使用含有α-亞麻酸的飼料顯著提高了雞胸肉中二十碳五烯酸的含量[47]。圖6F表明,與鮮雞肉相比,貯存5 d的冰鮮雞肉二十碳五烯酸(144號)含量顯著升高,這與呂學澤等[48]的研究相似。由于肌肽和鵝肌肽通過抑制脂肪過氧化和蛋白質損傷保護肉類免受氧化[49],推測本實驗中二十碳五烯酸含量略微上升的原因與油脂的水解反應增多,以及雞肉中鵝肌肽和肌肽在冷藏過程中良好地保護了多不飽和脂肪酸,防止二十碳五烯酸的氧化2 個因素有關。冰鮮雞肉貯存中表現(xiàn)出的多不飽和脂肪酸保護作用并未在雞肉冷凍貯存過程中發(fā)現(xiàn),Miteva等[50]的研究表明雞肉冷凍貯存中不飽和脂肪酸顯著降低。

        除了上述與蛋白質和脂肪代謝相關的物質外,某些核苷酸類物質在肉類貯存中的風味變化中有重要意義。肌苷酸是肉類的主要風味成分,但是它在肉類中不穩(wěn)定,可以降解為肌苷和次黃嘌呤。在其降解產(chǎn)物中,肌苷和次黃嘌呤具有苦味,不利于肉類在貯藏過程中的風味變化[51-52]。因此,肌苷酸已成為衡量肉類新鮮度的重要指標。圖6G表明,貯存1 d的雞肉肌苷酸(185號)含量顯著降低,與肌苷酸極不穩(wěn)定的特性一致,說明冰鮮雞肉風味發(fā)生不良轉變,食用品質有所降低。

        圖6 雞肉樣品代謝物含量變化Fig. 6 Changes in metabolite contents in chicken samples

        綜合上述分析,這7 種蛋白質、脂肪和核苷酸降解產(chǎn)物反映了雞肉貯存中的生化過程和風味變化,可以作為冰鮮雞肉的代謝標志物。從代謝物的角度看,貯存時間在5 d內的冰鮮雞可以認為與鮮雞肉代謝物相似性更高,隨著貯存時間的延長,冰鮮雞肉與鮮雞肉代謝物差異逐漸增加。

        3 結 論

        本實驗基于代謝組學方法,結合OPLS模型鑒別不同貯存時間的冰鮮雞肉和鮮雞肉,分析各個雞肉樣品的多種代謝物,闡述了貯存時間對雞肉代謝物的影響。篩選了29 種差異物,并經(jīng)過二級質譜的匹配,確定9 種物質的結構式,包括蛋白質、脂肪和核苷酸降解產(chǎn)物等。隨著貯存時間的延長,雞肉中苯丙氨酸、色氨酸、棕櫚酸和二十碳五烯酸含量有所上升,肌肽、鵝肌肽和肌苷酸等物質含量有所降低,表明貯存時間的延長會造成雞肉抗氧化物質減少,雞肉風味改變,促進了冰鮮雞肉中脂肪酸的形成與穩(wěn)定。從代謝物角度來說,貯存時間在5 d內的冰鮮雞肉與鮮雞肉代謝物構成上最為接近。本實驗表明基于LC-QTOF MS代謝組學方法結合OPLS模型,對冰鮮雞肉和鮮雞肉的鑒別具有可行性,為冰鮮雞的質量安全與品質評價提供數(shù)據(jù)支撐。后續(xù)應進一步研究相關標志物的形成機制與變化規(guī)律,為調控蛋白質和呈味核苷酸的降解、提高冰鮮雞產(chǎn)品品質提供理論依據(jù)。此外,本實驗針對北京油雞品種的冰鮮雞肉和鮮雞肉代謝物進行分析,后續(xù)可以考慮應用在其他品種雞肉樣本中,為全面分析冰鮮雞肉和鮮雞肉代謝物標志物提供參考。

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