楊玲玲， 劉凡值， 孟慶楊， 申 剛

(1.貴州省農業(yè)科學院亞熱帶作物研究所， 貴州 興義 562400；2.貴州師范大學生命科學學院， 貴陽 550006)

薏苡(Coixlacryma-jobiL.)是重要的藥食同源經濟作物，既是營養(yǎng)成分豐富的小雜糧，又是藥效廣泛的中藥材，整個植株均含有多種功能活性成分，包括油脂、多酚、類黃酮、多糖、維生素及礦物元素等。薏苡具有多種保健功能，但是，目前生產用種相對單一，單產不高，綜合性狀差，優(yōu)質薏苡新品種缺乏，嚴重制約了薏苡生產的發(fā)展，亟需大力開展薏苡的遺傳育種研究，以推進薏苡種植業(yè)的良好發(fā)展[1-2]。

人工誘變育種是通過利用物理、化學等因素來誘發(fā)作物產生所需性狀的育種方法。該育種方法能夠有效解決種質資源匱乏的問題，且操作簡單、成本較低、大小規(guī)模均可運用[3]。60Co-γ射線和EMS是實踐中常用的兩種誘變劑，其中60Co-γ射線是一種相較于其他輻射源(X射線、β射線、激光、中子、紫外線、離子束等)更具能量及穿透性的電磁輻射形式[4-7]，能破壞或改變作物細胞的重要成分，且不同輻射劑量對作物在形態(tài)、生理生化等方面產生不同的影響；EMS能通過核苷酸取代，特別是通過鳥嘌呤烷基化，讓作物遺傳物質產生隨機突變[8-9]，因此，60Co-γ射線誘變和EMS誘變被廣泛地應用到作物新品種育種中，例如水稻[10]、小麥[11]、高粱[12]、大豆[13]、甘蔗[14]等。相關研究顯示，誘變劑處理作物時，劑量的變化可以調節(jié)突變的頻率及飽和度，則對作物產生不同影響，并且不同誘變劑對同種作物產生的影響也不同，John等[15]研究發(fā)現，在相關作物中EMS誘變比物理誘變劑更有效。因此，探究適合的誘變劑及適宜的劑量(特別是半致死劑量)對高效、合理地開展人工誘變育種工作具有重大意義。

目前，在薏苡人工誘導育種工作中，利用輻射誘變進行新種質創(chuàng)制的研究還比較少，如沈曉霞等[16]、劉鵬飛等[17]分別初步探討了γ射線對薏苡種子的誘變作用，但利用EMS等化學誘變劑處理薏苡的研究未見報道。本研究分別探討了60Co-γ射線和EMS對薏苡CDT及Y 159的誘變作用，旨在篩選60Co-γ輻照和EMS誘變薏苡種子的最適劑量(濃度)，為薏苡相關育種工作提供一定的理論指導。

1 材料與方法

1.1 材 料

本試驗材料為泰國栽培型薏苡CDT、中國云南野生薏苡Y 159。

1.2 方 法

將每種材料的2 100粒去殼種子平均分成7袋。分別用7個劑量(150、250、350、450、550、650、750 Gy)的60Co-γ射線對種子進行輻照處理，未經輻照處理(0 Gy)的種子作為對照(ck)。將去殼的薏苡Y 159種子分成13袋(每袋100粒)，分別放入不同濃度(0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%、2.4%、2.8%、3.2%、3.6%、4.0%、4.4%、4.8%、5.2%)EMS處理液中浸泡10 h，未經EMS處理的為對照組，每個處理重復3次。10 h后，從EMS處理液中取出種子，用無菌蒸餾水沖洗5次，以避免過度處理和EMS的殘留。

將處理組及對照組種子分別種植在盛有泥炭蘚的育苗盤中，種子深度為1 cm。將育苗盤置于溫度為26 ℃、相對濕度為80%的溫室中，每2天澆水一次。進行數據收集，從播種后第12天開始，按公式計算每批種子的發(fā)芽率。

發(fā)芽率(%)=(發(fā)芽數/供試種子總數)×100%，

根據發(fā)芽率計算半致死劑量。

苗長出3～4片葉片(播種后25 d)后測量幼苗株高(測苗基部至根尖的長度)。根據對照植株的特性計算突變率。

突變率(%)=(突變株數/總株數)×100%。

對數據進行整理及分析。

2 結果與分析

2.1 不同60Co-γ劑量輻照對薏苡種子萌發(fā)的影響

薏苡種子在播種后的第4天開始萌發(fā)，第12天萌發(fā)結束。觀察結果顯示，隨著輻射劑量的增加，2個薏苡品種(CDT和Y 159)種子萌發(fā)均發(fā)生延遲，且當輻照劑量超過350 Gy時延遲效果明顯；低劑量輻射能提高薏苡種子(CDT和Y 159)的發(fā)芽率，第4天和第5天，150 Gy和250 Gy輻照種子的發(fā)芽率顯著高于對照，且不同品種的發(fā)芽率不同(表1)。

表1 不同60Co-γ劑量輻照對播種后4、5、6、8、12 d薏苡種子發(fā)芽率的影響

分析可知，所有劑量的輻照對薏苡種子萌發(fā)均有顯著影響，隨著輻照劑量的增加，發(fā)芽率逐漸降低，并且輻照劑量對薏苡種子萌發(fā)的影響因品種而異，其中對薏苡Y 159種子萌發(fā)的影響較為明顯。具體來看，對于薏苡Y 159，0 Gy輻照處理和150 Gy輻照處理的發(fā)芽率均顯著高于其他處理組種子的發(fā)芽率，且當輻照劑量超過450 Gy時，幾乎所有種子都不能萌發(fā)；對于薏苡CDT，0 Gy輻照處理和250 Gy輻照處理的發(fā)芽率均顯著高于其他處理組種子的發(fā)芽率，且輻照對薏苡CDT種子萌發(fā)的影響較小，當輻照劑量達到750 Gy時仍有10.7%的種子發(fā)芽。因此，根據以上測量的不同60Co-γ劑量輻照下的種子發(fā)芽率，初步可知150～450 Gy的輻照劑量適合薏苡CDT和Y 159(表2)。

表2 不同60Co-γ劑量輻照下薏苡CDT和Y 159種子的發(fā)芽率

2.2 不同60Co-γ劑量輻照對薏苡幼苗生長的影響

在播后25 d時，對薏苡植株的突變率和株高進行了測定，其中植株突變的判斷標準是輻照植株與對照植株(0 Gy)表現出不同的葉形時，則為突變體。結果(表3)顯示，薏苡CDT和Y 159植株的突變率隨輻照劑量的增加而增加，低劑量輻照對植株突變率影響不大，但從250 Gy開始，隨著輻照劑量的增加，突變率急劇增加，在450 Gy時突變率幾乎達到100%。輻照劑量對薏苡幼苗生長速率也有顯著影響，隨著輻照劑量的增加，幼苗株高逐漸降低，進一步分析可知，150 Gy以上的輻照顯著抑制薏苡幼苗生長，且呈劑量依賴性，而輻照劑量達到450 Gy及以上，幼苗停止生長。因此，由上可推斷輻照劑量對2個薏苡品種的幼苗生長均有顯著影響。

表3 不同60Co-γ劑量輻照下薏苡植株突變率及株高

2.3 EMS處理對薏苡種子萌發(fā)及幼苗生長的影響

由表4可知，不同濃度EMS誘變劑對薏苡Y 159的種子發(fā)芽率和幼苗的突變率、株高有顯著影響。結果顯示，隨著EMS濃度的增加，種子發(fā)芽率逐漸降低，且當濃度低于1.2%時，發(fā)芽率受影響程度不大，高于1.2%時，發(fā)芽率明顯受影響，而當濃度大于4.4%時，Y 159種子的發(fā)芽率接近于零；EMS濃度對幼苗突變率也有很大影響，雖然低濃度EMS對突變率無顯著影響，但當濃度高于1.2%時，隨著濃度的增加，突變率逐漸顯著增加，且當濃度高于4.0%時Y 159植株的突變率達100%；另外，幼苗的生長對EMS也很敏感，當EMS濃度大于0.4%時，生長速率受到影響，當濃度超過1.2%時，生長速率顯著下降，而這種抑制作用在2.0%、2.4%、3.2%、3.6%和4.0%時略有減輕，表明EMS對幼苗株高的影響并不是完全由EMS濃度決定的。

表4 EMS處理對薏苡Y 159的種子發(fā)芽率和幼苗突變率、株高的影響

2.4 60Co-γ輻照和EMS誘變下薏苡半致死劑量的研究

根據種子發(fā)芽率[18]，利用統(tǒng)計軟件SPSS 20.0確定半致死劑量(LD50)。結果表明，60Co-γ輻照處理下，薏苡CDT和Y 159的回歸方程各為LD50=2.222-0.005X和LD50=2.053-0.007X(X=種子發(fā)芽率)，則計算出薏苡CDT和Y 159的半致死劑量分別為406.305 Gy和284.795 Gy；EMS誘變處理下，薏苡Y 159的回歸方程為LD50=1.807-0.737X，X為種子發(fā)芽率，計算出薏苡Y 159的半致死劑量為2.453%。

3 結論與討論

人工誘變方法能夠在任何作物中短時間內高效獲取大量無序的突變后代，是一種獲得育種資源的有效途徑。本研究結果顯示，經過誘變處理后，薏苡種子的萌發(fā)受到了明顯的抑制，萌發(fā)時間延遲，且隨著誘變劑濃度(劑量)的增加，種子的發(fā)芽率呈逐漸下降的趨勢，與Datir等[19]在木豆中的研究結果相一致，Kumar[20]研究發(fā)現，黃秋葵的發(fā)芽率通常隨著γ射線劑量和EMS濃度的增加而降低；松屬植物[21]、鷹嘴豆[20]等的發(fā)芽率也隨著γ輻照劑量的增加而降低。相關研究表明，在誘變劑處理下，種子發(fā)芽率降低可能是由誘變劑對種子分生組織產生影響而導致的[22]，由此推測在高劑量60Co-γ和高濃度EMS誘變下，薏苡種子發(fā)芽率變低可能是由于這兩種誘變劑分別對薏苡種子在細胞水平上產生了物理或生理水平的干擾。

本試驗中出現的薏苡種子發(fā)芽率、幼苗突變率依賴誘變劑劑量變化而變化以及不同誘變劑對不同品種的薏苡產生的影響不同的現象，表明選擇合適的誘變劑及劑量是實踐中薏苡誘變育種成功的關鍵。在利用物理或化學誘變劑對相關作物進行人工誘變時，半致死劑量被認為是用來處理原始材料的最佳劑量[18]。經計算可知，在60Co-γ輻照處理下，薏苡CDT和Y 159的半致死劑量分別為406.305 Gy和284.795 Gy，在EMS誘變處理下，薏苡Y 159的半致死劑量為2.453%，由此可以進一步推測，相較于薏苡CDT，Y 159對60Co-γ輻照更敏感，且對于同種作物不同品種的誘變原始材料，其適宜的誘變劑處理濃度不相同。

本研究結果表明，利用不同誘變劑以及同種誘變劑不同處理濃度(劑量)進行誘變處理時，薏苡CDT和Y 159幼苗發(fā)生顯著突變，主要表現為葉型變異以及株高顯著降低，這與沈曉霞等[16]的研究結果相一致。其中薏苡Y 159作為野生薏苡，具有品質優(yōu)、抗性好、產量高和多年生等優(yōu)點，是優(yōu)異的育種原始材料，但與其他野生薏苡資源一樣，Y 159植株高度過高，不抗倒伏，而本研究60Co-γ輻照和EMS處理能降低薏苡幼苗株高，有望為以后在薏苡種質創(chuàng)新中更好地利用野生薏苡資源提供參考。