王 芬， 張龍芬， 木 仁， 馬 媛， 郭治友， 崔寶祿， 李 靜， 張 雯

(1.黔南民族師范學(xué)院生物科學(xué)與農(nóng)學(xué)院， 貴州 都勻 558000；2.長順縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局， 貴州 長順 550700)

茶產(chǎn)業(yè)是“一帶一路”國家戰(zhàn)略中的傳統(tǒng)優(yōu)勢特色外向型產(chǎn)業(yè)，發(fā)展前景廣闊。茶樹是世界上最受歡迎的非酒精飲料作物之一[1]，也是非常重要的商業(yè)化飲料作物[2]；茶樹是中國西南地區(qū)的特有種，目前種植在40多個(gè)國家[3-4]。貴州特有的喀斯特地貌氣候呈立體結(jié)構(gòu)，年均降水量1 500 mm，適宜的溫度孕育了豐富多樣的茶樹資源[5]，是茶樹的發(fā)源地及茶葉經(jīng)濟(jì)的故鄉(xiāng)[6]。截止2016年，貴州的茶葉種植面積達(dá)到4.4×105hm2，是茶葉種植面積最大的省份[7]，主要品種為福鼎大白茶，具有繁殖力強(qiáng)、產(chǎn)量高、品質(zhì)好、適應(yīng)性廣的特性。茶葉的流行不僅僅是因?yàn)樘厥獾娘L(fēng)味，更是由于主要的次生代謝產(chǎn)物——茶多酚[9-10]。它對(duì)人體有益[11]，可以抗菌[12]，抗腫瘤，具有抗氧化活性[13-15]，對(duì)心血管疾病、肥胖、糖尿病和代謝綜合征都有療效[16-17]。

蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)[18]是指一個(gè)物種內(nèi)的所有蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系，并從信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生化等角度進(jìn)行研究。揭示蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系，構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，已成為蛋白組學(xué)[19]研究的熱點(diǎn)，也是后基因組時(shí)代的難題所在。蛋白質(zhì)相互作用是生物體進(jìn)行代謝活動(dòng)的基礎(chǔ)，因此，在所有生命活動(dòng)中，都有蛋白質(zhì)相互作用現(xiàn)象的發(fā)生。研究都勻毛尖的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)可以對(duì)茶的整個(gè)生物過程有一個(gè)綜合的理解。

以貴州省黔南州喀斯特山區(qū)優(yōu)勢茶葉品種福鼎大白種茶為材料，利用二代Illumina測序平臺(tái)對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，分析根莖葉的差異基因，構(gòu)建差異基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。挖掘都勻地區(qū)福鼎大白種茶參與類黃酮生物合成、萜類化合物生物合成等代謝途徑的相關(guān)基因，揭示影響茶多酚代謝的關(guān)鍵因素，為培育更好的茶樹品種探尋茶多酚代謝機(jī)理提供參考。

1 材料和方法

1.1 材 料

試驗(yàn)材料福鼎大白種茶樹(Camelliasinensis(L.)O.Ktze)，是2018年11月在黔南州都勻市紅敏茶園剪取的枝葉扦插所得，在培育的茶苗中選取培養(yǎng)條件相同、長勢情況基本一致、沒有被污染的茶苗植株9盆，分為3組，分別取嫩根、嫩莖和嫩葉標(biāo)為“根1重復(fù)、根2重復(fù)、根3重復(fù)，莖1重復(fù)、莖2重復(fù)、莖3重復(fù)、葉1重復(fù)、葉2重復(fù)、葉3重復(fù)”，放入液氮中再放入-80 ℃冰箱保存。

1.2 方 法

將二代Illumina測序得到的結(jié)果進(jìn)行基因表達(dá)量分析，并進(jìn)一步分析葉與莖、葉與根、莖與根的差異表達(dá)基因，運(yùn)用同源比對(duì)的方法將差異基因與STRING 9.1數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)以及提取出差異表達(dá)分析結(jié)果與STRING 9.1數(shù)據(jù)庫收錄的互作關(guān)系，再利用Cytoscape 3.3.0將比對(duì)上的差異基因進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，分別構(gòu)建出葉與莖、葉與根、莖與根的差異基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)并對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行合并。

2 結(jié)果與分析

2.1 差異基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

利用Illumina測序平臺(tái)對(duì)福鼎大白種進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，根據(jù)基因表達(dá)量篩選根、莖、葉的差異基因，通過同源比對(duì)的方法以及差異表達(dá)分析結(jié)果和STRING 9.1數(shù)據(jù)庫收錄的互作關(guān)系對(duì)，構(gòu)建差異基因的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(表1)。

表1 差異基因蛋白質(zhì)相互作用數(shù)目

2.2 差異基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵傩?/h3>

將葉與莖、葉與根、莖與根的差異基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)合并為一個(gè)大的綜合差異基因互作網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)共4 249個(gè)節(jié)點(diǎn)，66 342個(gè)互作。從聚合系數(shù)、直徑、半徑、最短路徑、特征路徑長度等方面對(duì)4個(gè)網(wǎng)絡(luò)的特性進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)差異不顯著，并且網(wǎng)絡(luò)表現(xiàn)出小世界特性(表2)，大部分節(jié)點(diǎn)不與彼此鄰接，但是可以從任一其他點(diǎn)經(jīng)少數(shù)幾步就可到達(dá)。

表2 4個(gè)網(wǎng)絡(luò)的全局特性

中介中心性的值介于0與1之間，是指網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)充當(dāng)其它兩個(gè)節(jié)點(diǎn)之間最短路徑的中介次數(shù)，次數(shù)越高，中介中心性就越大(圖3 a)。蛋白i的度是與此蛋白相連節(jié)點(diǎn)數(shù)，即蛋白i的互作數(shù)目，i的度越高，說明蛋白i越重要。在葉和莖、葉和根、莖和根以及合并的網(wǎng)絡(luò)中，發(fā)現(xiàn)節(jié)點(diǎn)的度符合冪律分布(圖3 b)，其中葉與根的差異基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中，P(x)≈854.28x-1.174，R2=0.738，相關(guān)性是0.959。葉與莖的網(wǎng)絡(luò)中，P(x)≈509.82x-1.194，R2=0.747，相關(guān)性是0.955。莖與根的網(wǎng)絡(luò)中，P(x)≈543.96x-1.281，R2=0.759，相關(guān)性是0.863。在合并的網(wǎng)絡(luò)中，P(x)≈888.33x-1.15，R2=0.692，相關(guān)性是0.939。說明大多數(shù)蛋白的相互作用數(shù)較少，很少一部分蛋白質(zhì)的連接度較高，是一種無尺度現(xiàn)象。接近中心性的值也介于0和1之間，是指網(wǎng)絡(luò)中的一個(gè)節(jié)點(diǎn)與其它節(jié)點(diǎn)的接近程度，即一個(gè)節(jié)點(diǎn)到其它節(jié)點(diǎn)的平均最短路徑的倒數(shù)(圖3 c)。蛋白u(yù)的拓?fù)湎禂?shù)是Tu=avg(S(u,v))/nu。S(u,v)表示u和v共同的相鄰蛋白數(shù)，nu表示u的鄰居數(shù)(圖3 d)。

2.3 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中功能模塊分析

在葉與莖、葉與根、莖與根以及合并的差異基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中，利用Cytoscape 3.3.0的插件MCODE分別預(yù)測出66、99、62個(gè)和110個(gè)功能模塊(表3)，參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)，對(duì)于蛋白質(zhì)功能預(yù)測以及揭示各種生化反應(yīng)過程的分子機(jī)理都有著極大的幫助。葉與根差異基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中最大的功能模塊(圖2)得分為56.941，具有120個(gè)節(jié)點(diǎn)，3 388個(gè)互作，主要參與植物病原互作通路，植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等。

表3 差異基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中的功能模塊特性

2.4 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中蛋白質(zhì)的功能與關(guān)鍵蛋白預(yù)測

利用差異基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)可以預(yù)測蛋白質(zhì)的功能。在一個(gè)蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中，如果已知某些蛋白質(zhì)的功能，那么與之相連的其他蛋白可能具有類似的功能。葉與莖的差異基因蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中共15 764個(gè)互作，其中TEA 003744，TEA 019056，TEA 020779，TEA 005686，TEA 008246，TEA 000931，TEA 024511，TEA 033307是相互作用數(shù)最多的8個(gè)蛋白(表4)，它們在功能上具有相似性。TEA003744是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，具有ATP結(jié)合功能，參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，與其互作的蛋白有281個(gè)，由此可以推出這281個(gè)蛋白也可能具有類似的功能。

表4 葉與莖差異基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵蛋白

利用Cytoscape 3.3.0提取葉與莖差異基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中最大的一個(gè)子網(wǎng)(圖3)，具有1 062個(gè)節(jié)點(diǎn)，13 726個(gè)邊，紅色的節(jié)點(diǎn)代表度最大的8個(gè)節(jié)點(diǎn)，與整體網(wǎng)絡(luò)一致，通過子網(wǎng)也可以預(yù)測蛋白質(zhì)的功能。

3 討 論

利用STRING 9.1數(shù)據(jù)庫和同源比對(duì)方法預(yù)測出葉與莖有15 764個(gè)蛋白質(zhì)相互作用，葉與根有49 191個(gè)相互作用，莖與根11 406個(gè)互作，合并的網(wǎng)絡(luò)共有66 342個(gè)相互作用。4個(gè)網(wǎng)絡(luò)都符合冪律分布，即少部分蛋白具有高連接度，而大部分蛋白的連接度較低。葉與根的差異基因的蛋白質(zhì)相互作用最多，可能由于葉與根差異基因較多導(dǎo)致。對(duì)四個(gè)網(wǎng)絡(luò)的聚合系數(shù)、直徑、半徑、最短路徑、特征路徑長度等特性進(jìn)行比較分析，差異不大，并且網(wǎng)絡(luò)表現(xiàn)出小世界特性。

利用Cytoscape 3.3.0的插件MCODE分別預(yù)測出4個(gè)網(wǎng)絡(luò)的功能模塊，對(duì)于蛋白質(zhì)功能預(yù)測意義重大。其中茶多酚相關(guān)功能模塊打分為9.412，具有18個(gè)節(jié)點(diǎn)和80個(gè)互作(圖3)。該18個(gè)蛋白主要是細(xì)胞色素P 450、香葉醇8-羥化酶、氧化酶、類吡喃二烯氧合物、類黃酮。全部參與茶多酚次生代謝產(chǎn)物的生物合成、運(yùn)輸和代謝，主要表現(xiàn)為油菜素類固醇生物合成、類黃酮生物合成、二萜生物合成、倍半萜和三萜生物合成、甲基赤蘚糖4-磷酸途徑。分子功能主要體現(xiàn)在氧化還原酶、金屬離子結(jié)合、芳香化酶活性等。因此，推斷18個(gè)蛋白均與茶多酚功能相關(guān)，為培養(yǎng)茶樹新品種提供理論依據(jù)。

通過差異基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)可以預(yù)測蛋白質(zhì)的功能。都勻毛尖福鼎大白茶富含茶多酚，具有提神醒腦、抑制動(dòng)脈粥樣硬化、抑菌抗癌等功能。都勻毛尖特有的芳香主要自類黃酮和萜類化合物等的代謝，通過差異蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)可以預(yù)測與類黃酮等物質(zhì)相關(guān)的基因。本研究結(jié)果可為類黃酮等物質(zhì)的代謝機(jī)理研究提供一定的理論依據(jù)，為培養(yǎng)良種茶樹提供理論參考。