戴銘睿,索良東,康濰循,郭麗穎,高 歆,曹英琪,黃興宇,王志強,馮程宇,曲 靜,賀小英*

(1.內(nèi)蒙古科技大學生命科學與技術學院,內(nèi)蒙古包頭 014010;2.赤峰市醫(yī)院耳鼻喉科,內(nèi)蒙古赤峰 024000)

動物毒理損傷是指外源因素包括化學、物理和生物因素等對動物機體的損害,肝臟與腎臟是哺乳動物對外界有害物響應的重要器官。當今,尋找科學有效的手段用于評價動物毒理損傷是生物學和醫(yī)學領域一直以來研究的熱點。通常,國際上采用理化分析方法,該方法具有準確、靈敏和快速的特點,在動物毒理損傷的研究過程中起著重要作用。然而,理化分析存在動態(tài)不穩(wěn)定,不太適合動物毒理或病理學的診斷的缺點[1]。近年來,利用分子標志物對動物毒理學和病理學的研究成為了關注的焦點。此外,ICR小鼠因為與人的基因具有較高的同源性因此可作為用來對人類毒理學及病理學進行評估較為理想的模式生物。通過前期的調(diào)查發(fā)現(xiàn)受污染的地下水會對ICR小鼠的肝臟和腎臟功能造成遺傳性損傷[2]。因此,為了進行篩選針對肝、腎損傷的分子標志物,本試驗構建了ICR小鼠毒性損傷的病理學模型,并對小鼠肝臟、腎臟樣本進行高通量測序,篩選出顯著上調(diào)基因,繪制基因功能交叉分類韋恩圖,根據(jù)基因功能分類及基因信號通路富集篩選可作為分子標志物的基因,并在細胞水平上觀察其形態(tài)損傷影響和分子標記基因進行驗證。本研究旨在為有毒有害物對于生物體肝、腎損傷的診斷和健康評價提供一種新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 4周齡ICR雌性小鼠,購于斯貝福(北京)生物技術有限公司,飼養(yǎng)于內(nèi)蒙古科技大學動物實驗室,通風良好,溫度20～25℃,濕度50%～60%,自由采食。本試驗動物來源及使用操作均嚴格遵循動物倫理要求。

1.1.2 主要試劑 75%乙醇,天津市風船化學試劑科技有限公司產(chǎn)品;0.9%生理鹽水,山東齊都藥業(yè)有限公司產(chǎn)品;硝酸,北京化學試劑廠產(chǎn)品。

1.1.3 儀器設備 二氧化碳培養(yǎng)箱(Galaxy S 型) RS Biotech公司產(chǎn)品;熒光倒置顯微鏡(AE30/31+型),日本尼康株式會社產(chǎn)品;水浴鍋(Thermo Scientific 型),萊恩德智能科技有限公司產(chǎn)品;分析天平(MP6001型),上海精密科學儀器有限公司產(chǎn)品;Real-time PCR儀(Thermo Scientific 型),英濰捷基上海貿(mào)易有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 小鼠毒性損傷模型制備 本研究采用的水樣點為北方某地礦區(qū)及尾礦庫,且該地區(qū)已被證實水質(zhì)受污染[2-3]。根據(jù)礦區(qū)水樣的位置不同,將小鼠分為L1～L5共5個組進行建模,將尾礦庫取樣水作用的小鼠分為2組,分別為滲漏水喂養(yǎng)的S組和庫內(nèi)水喂養(yǎng)的K組,同時設置對照組采用自來水喂養(yǎng),保持8個組小鼠飼喂條件相同,適應性培養(yǎng)7 d后進行每日定時進行灌胃,每只鼠每次0.2 mL,28 d為1個周期。

1.2.2 采取ICR小鼠肝臟和腎臟 試劑、容器、器械提前4℃預冷,用頸椎脫臼法處死小鼠后用75%乙醇對小鼠皮毛進行表面消毒,使用剪毛剪打開小鼠腹腔后換用新的鑷子和剪刀小心取出肝臟及腎臟,避免污染,使用生理鹽水沖洗血漬將臟器置于一次性無菌培養(yǎng)皿中,保存4℃用于后續(xù)研究。

1.2.3 高通量測序 所需基因文庫構建結束后,使用PCR擴增技術對基因文庫片段進行富集,根據(jù)片段大小進行文庫選擇,控制文庫大小在450 bp。進行質(zhì)檢后,對文庫總濃度及有效濃度進行檢測,然后將文庫進行混合。

樣品經(jīng)過RNA抽提、純化、建庫之后,采用二代測序技術(NGS),基于Illumina測序平臺,對這些文庫進行雙末端(paired-end,PE)測序。

2 結果

2.1 對肝臟的高通量的測序分析

小鼠經(jīng)北方某礦區(qū)滲漏水28 d灌胃后處死,采取其肝臟組織提取總RNA進行高通量測序,將得到的數(shù)據(jù)進行分類整理,篩選出pval<0.001的基因進行進一步分析得到基因表達差異火山圖(圖1)。

橫縱坐標分別表示試驗組(Case)和對照組(ctrl)生物學重復差異倍數(shù)FC值的對數(shù)值。根據(jù)基因表達差異倍數(shù)FC值的篩選,紅色圓點表示顯著的上調(diào)基因,綠色圓點表示顯著下調(diào)的基因,灰色圓點表示差異不顯著的基因。

L1與ctrl中差異基因共14個,其中呈現(xiàn)上調(diào)的差異基因共9個,呈現(xiàn)下調(diào)的基因有5個。L1與L5中下調(diào)較為顯著差異基因有20個,上調(diào)顯著差異基因35個。L5與ctrl下調(diào)顯著差異基因有40個,上調(diào)顯著差異基因有22個。

通過得到的數(shù)據(jù)可知,經(jīng)過礦區(qū)不同位置水樣灌胃的小鼠其肝臟器官部分基因表達出現(xiàn)了差異,現(xiàn)對其差異基因進行Venn圖處理(圖片未顯示)。以a1為L1組和ctrl的差異基因,b1為L5組與ctrl的差異基因,c1為L1組和L5組的差異基因,d1為L3和L5組的差異基因。其中a1與b1兩組相同差異基因有4個,a1與c1兩組相同差異基因有4個,b1與c1與兩組相同差異基因有23個,b1組、c1組和d1組3組相同差異基因有2個。

2.2 對腎臟的高通量的測序分析

通過高通量測序了解到了礦區(qū)水樣對小鼠腎臟的基因表達影響情況火山圖如下。

礦區(qū)L1取樣點樣水與內(nèi)蒙古科技大學自來水對小鼠進行灌胃28 d,后小鼠腎臟器官出現(xiàn)的基因表達差異如圖2所示。其中下調(diào)顯著差異基因有19個,上調(diào)顯著差異基因有11個。L1取樣點樣水與L5取樣點水對小鼠其中下調(diào)顯著差異基因有9個,上調(diào)顯著差異基因有16個。L3與ctrl其中下調(diào)顯著差異基因有9個,上調(diào)顯著差異基因有16個。L3與L5 出現(xiàn)的基因表達差異中下調(diào)顯著差異基因有2個,上調(diào)顯著差異基因3個。L5組與ctrl中下調(diào)顯著差異基因有11個,上調(diào)顯著差異基因有1個。

A.L1與ctrl ;B.L1與L5; C.L3與ctrl; D.L3與L5; E.L5與ctrl

對差異基因進行進一步分析,將所得部分差異基因進行韋恩圖繪制。

a2集合為L1組與對照組的差異基因,b2集合為L3與對照組的差異基因,c2集合為Y5與對照組的差異基因,d2組為L3與L5的差異基因,e2組為L1與L5的差異基因。其中a2與b2相同差異基因有2個,a2與c2兩交集有1個差異基因,a2與e2相同差異基因有5個,b2與c2相同差異基因有1個,b2與d2相同差異基因有1個,c2與d2相同差異基因有1個,c2與e2相同差異基因有12個,a2集合b2集合與e2集合相同差異基因有1個,a2集合b2集合d2集合與e2集合相同差異基因有1個。

2.3 某尾礦庫水對生物體的影響

2.3.1 對肝臟的高通量的測序分析 使用庫內(nèi)水與內(nèi)蒙古科技大學自來水對小鼠灌胃28d后小鼠肝臟器官出現(xiàn)的基因表達差異如圖3所示。

A.庫內(nèi)水組與ctrl; B.庫內(nèi)水組與滲漏水組; C.滲漏水組與ctrl

其中下調(diào)顯著差異基因有36個,上調(diào)顯著差異基因有55個。庫內(nèi)水組與滲漏水組差異基因中下調(diào)顯著差異基因有31個,上調(diào)顯著差異基因有18個。滲漏水與對照組差異基因中下調(diào)顯著差異基因有90個,上調(diào)顯著差異基因有102個。

篩選數(shù)據(jù)繪制肝臟差異基因韋恩圖,a3為庫內(nèi)水與ctrl差異基因,b3組為滲漏水與ctrl部分差異基因,c3組為滲漏水與庫內(nèi)水的部分差異基因。其中a3組與b3組相同差異基因有16個,b3組與c3組差異基因有15個。

2.3.2 對腎臟的高通量的測序分析 分別取得庫內(nèi)水以及滲漏水對小鼠灌胃28 d后對小鼠腎臟器官樣本進行高通量測序分析,分析結果如下。

其中下調(diào)顯著差異基因32個,上調(diào)顯著差異基因52個。庫內(nèi)水與滲漏水組間下調(diào)顯著差異基因23個,上調(diào)顯著差異基因12個。庫內(nèi)水與自來水對照組間下調(diào)顯著差異基因9個,上調(diào)顯著差異基因21個。

篩選處理數(shù)據(jù)后繪制部分腎臟差異基因韋恩圖處理后得(圖4)。a4組為庫內(nèi)水與對照組差異基因,b4組為滲漏水與對照組部分差異基因,c4組為滲漏水與庫內(nèi)水部分差異基因。a4組與b4組相同差異基因有27個,b4組與c4組差異基因有47個,a4,b4,c4 3個組相同差異基因共3個。

A.滲漏水組與ctrl; B.庫內(nèi)水組與滲漏水組; C.庫內(nèi)水組與ctrl

2.4 受污染水源對肝臟與腎臟的影響

通過以上試驗數(shù)據(jù)分析整理,我們可得知不同礦區(qū)水源,不同水源位置,對小鼠肝臟以及腎臟造成不同影響。在各個小組對比中我們可以看出,來源不同礦區(qū)水樣對小鼠灌胃處理后小鼠的腎臟肝臟影響導致不同差異表達基因。如果想要進一步發(fā)掘環(huán)境污染早期篩選及生態(tài)風險評價分子標志物,我們需要進一步縮小差異基因范圍。本試驗對不同水源地肝臟和腎臟器官差異表達基因進行進一步分析。

a5代表尾礦庫樣水對小鼠肝臟器官影響下差異表達基因,b5代表北方某礦區(qū)樣水對小鼠肝臟器官產(chǎn)生的差異表達基因,其中兩集合交集基因共23個,每個基因在本試驗每個小鼠體內(nèi)都有相同的調(diào)控方向。a6代表礦區(qū)樣水對小鼠腎臟器官差異表達基因,b6代表尾礦庫樣水對小鼠腎臟器官差異表達基因,其中兩集合交集基因共25個,且每個基因在本試驗的每個小鼠體內(nèi)都具有相同的調(diào)控方向。

2.5 體外培養(yǎng)細胞系毒理學形態(tài)觀察

使用具有主要影響作用的重金屬離子與鹽離子摸索最適損傷濃度對體外培養(yǎng)的NRK細胞進行脅迫作用,其Mn2+濃度為900 μmol/mL、Zn+濃度為570 μmol/mL、F-濃度為15 mmol/mL、Cl-濃度為150 mmol/mL對細胞形態(tài)以及數(shù)量具有顯著影響。

3 討論

生物體可以通過不同的途徑接觸到有毒有害物造成不同程度的肝腎損傷,比如飲用受污染的水、呼吸道傳播、給藥等。經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn),在內(nèi)蒙古東部某醫(yī)院2013年至今,凡從事礦區(qū)或冶煉工作的人群,通過耳鼻喉長期接觸污染源,最終會合并嚴重肝腎損傷病例(數(shù)據(jù)未顯示)。因此,尋找有毒有害污染的分子標志物對動物乃至人類肝腎疾病的診斷治療具有重要意義。

本試驗通過研究小鼠肝臟和腎臟基因表達差異現(xiàn)象,并對不同水樣灌胃小鼠肝臟和腎臟差異表達基因數(shù)據(jù)進行篩選分析。得到了不同組別中相同差異表達基因。這些基因對發(fā)現(xiàn)和探尋環(huán)境污染早期診斷以及生態(tài)風險評估分子標志物提供了理論基礎。通過分析北方某礦區(qū)與尾礦庫樣水對小鼠肝臟基因的差異表達數(shù)據(jù)得到了顯著差異基因23個以及腎臟顯著差異基因25個。針對這些顯著差異基因進行檢索查閱,這些基因按功能分類如表1所示。

表1 差異基因功能分類表

這些基因主要富集在小鼠的免疫、基因表達調(diào)控、代謝、癌變、凋亡等方面有主要影響。其中Chordc1基因與Cry1基因在兩個礦區(qū)小鼠肝臟和腎臟差異表達基因中均有高表達出現(xiàn),因此可以初步推斷Chordc1基因與Cry1基因具有作為分子標志物的研究價值,其中Chordc1基因可調(diào)節(jié)中心體復制,也可以抑制ROCK2的激酶活性,對肌動蛋白細胞骨架重塑也有一定的調(diào)控作用,同時參與了哺乳動物大腦的晝夜節(jié)律與穩(wěn)態(tài)機制[3]。Cry1基因可參與構成生物鐘核心成分的轉錄抑制因子,在肝臟中對維持全身葡萄糖穩(wěn)態(tài)至關重要[4]。該基因可通過與膜偶聯(lián)G蛋白結合并阻斷胰高血糖素介導的細胞內(nèi)cAMP濃度增加和CREB1磷酸化,介導cAMP信號傳導和糖異生的晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)[5]。也可以通過降低下調(diào)糖異生基因表達的核FoxO1水平來抑制肝糖異生[6]。在調(diào)節(jié)細胞周期和代謝方面有一定的作用[7]。

分子標志物在醫(yī)療診斷、動物毒理及環(huán)境污染等領域的貢獻已經(jīng)逐漸顯現(xiàn)出來,更為準確、快速、高效的分子標志物將逐漸被各個領域發(fā)現(xiàn)并應用。本試驗所得的小鼠體內(nèi)Chordc1基因與Cry1基因對于尾礦地區(qū)環(huán)境污染診斷問題有較重要的實際意義,可以通過對Chordc1基因在免疫系統(tǒng)中所參與的調(diào)控方式進行研究[8],探明小鼠體內(nèi)出現(xiàn)的較為顯著的生理指標,建立與環(huán)境污染程度匹配的參考體系,從而準確快速靈敏的做到環(huán)境污染早期檢測與生態(tài)風險評估功能。對于Cry1基因注重其代謝方向產(chǎn)生影響,現(xiàn)有研究表明其與重度抑郁癥,失眠和焦慮[9],晝夜節(jié)律有較為密切的關聯(lián)[10]?？梢葬槍hordc1基因與Cry1基因展開更為深層次研究,例如通過對Chordc1基因與Cry1基因的表達過程,下游分子通路探究及功能回復驗證進行研究,可進一步提高該基因的分子標志物準確性。對該基因進行Spring分析,篩選下游潛在靶標互作分子,采用敲低質(zhì)粒敲低該基因,qPCR檢測靶標分子表達量判斷是否與其GEO數(shù)據(jù)庫的生物信息學分析變化趨勢一致,可選取變化最顯著的靶標分子作為研究目標進一步探尋與蛋白的互作模式。