齊佳欣,邵明杰,崔 平,張玉良,張鶴平*,肖躍強(qiáng)*

(1.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院,河北邯鄲 056021;2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院,山東濱州 256600;3.濱州市畜牧獸醫(yī)管理服務(wù)中心,山東濱州 256600;4.無棣縣畜牧獸醫(yī)管理服務(wù)中心,山東無棣 251900)

1885年,沙門氏菌(Salmonella)首先從感染豬瘟病毒的豬腸道中發(fā)現(xiàn)并分離。目前,沙門氏菌屬分為邦戈爾沙門氏菌(Salmonellabongori)和腸道沙門氏菌(Salmonellaenterica)等,其中腸道沙門氏菌血清型已經(jīng)發(fā)現(xiàn)2 600多種[1]。馬流產(chǎn)沙門氏菌是腸道沙門氏菌成員,為宿主適應(yīng)型,僅對馬屬動物致病,最早出現(xiàn)在18世紀(jì)末至19世紀(jì)初的美洲和歐洲地區(qū),我國于20世紀(jì)70年代末在華北、西北、東北等養(yǎng)馬地區(qū)陸續(xù)發(fā)生由該菌引起的馬流產(chǎn)沙門氏菌病[2]。該病全年均可發(fā)生,多發(fā)生于春、秋兩季,呈散發(fā)及地方性流行。馬屬動物感染無年齡限制,但以初產(chǎn)母畜和幼駒的易感性最高[3]。馬流產(chǎn)沙門氏菌以垂直和水平兩種方式傳播,感染動物是重要的病原攜帶者和傳播者,感染母馬從陰道向外界排菌時長達(dá)幾周。有研究報道由該菌引起的母馬流產(chǎn)率為10%～60%,若病原菌初次傳入未發(fā)生過疫情的養(yǎng)殖場,流產(chǎn)率可高達(dá)90%[4]。高星熠等[5]對山東聊城、德州、濱州等地的9個規(guī)模化驢場進(jìn)行調(diào)查,在流產(chǎn)癥狀樣品中,馬流產(chǎn)沙門氏菌檢出率最高,為44.29%;高楠楠[6]發(fā)現(xiàn)山東、內(nèi)蒙古、遼寧和河南等4省份11家中小規(guī)模驢養(yǎng)殖場均存在較為嚴(yán)重的繁殖障礙性問題,122份流產(chǎn)胎兒樣品確診為流產(chǎn)沙門氏菌的比例達(dá)94.3%。論文對馬流產(chǎn)沙門氏菌引起的臨床癥狀、致病機(jī)制、疫苗研制等方面進(jìn)行綜述,旨在為更好地開展馬流產(chǎn)沙門氏菌病的預(yù)防、控制和凈化等提供參考。

1 臨床癥狀

1.1 母馬

馬流產(chǎn)沙門氏菌不僅可引起母馬流產(chǎn),還會引起子宮內(nèi)膜炎等。母馬感染初期癥狀不明顯,通常為亞臨床感染,在感染后期,孕馬對外界刺激反應(yīng)減弱,并伴有體溫升高、精神沉郁、食欲不振、腹瀉等癥狀。嚴(yán)重的反應(yīng)強(qiáng)烈,表現(xiàn)為頻頻踢腹、乳房腫脹、陰門水腫、陰道血樣液體流出等。孕馬流產(chǎn)多發(fā)于妊娠中后期,流產(chǎn)前排尿次數(shù)增加、陰道有血液流出[7]。流產(chǎn)后,母馬可發(fā)生子宮內(nèi)膜炎及陰道炎,導(dǎo)致長時間發(fā)情不規(guī)律、排卵不正常、受孕率降低從而影響配種,但多數(shù)母馬可自行好轉(zhuǎn),若治療不及時,極少數(shù)母馬可繼發(fā)感染發(fā)生瘺管萎縮、敗血癥、化膿性關(guān)節(jié)炎、胃擴(kuò)張以及腸梗阻等,甚至死亡[8]。

1.2 公馬

馬流產(chǎn)沙門氏菌可引起公馬睪丸炎,主要表現(xiàn)為體溫升高、食欲減退、結(jié)膜潮紅或黃染、陰囊和睪丸水腫。也會出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎和鬐甲部膿腫等癥狀,有時膿腫破潰會形成瘺管甚至出現(xiàn)鬐甲炎[9]。

1.3 幼駒

無臨床癥狀的母馬所產(chǎn)小馬駒,表現(xiàn)為體溫升高(可高達(dá)41℃),并伴有嗜睡、嚴(yán)重腹瀉等癥狀,嚴(yán)重者在2～3 d內(nèi)死亡[3]。多數(shù)流產(chǎn)胎兒為死胎,伴隨胎衣一起分娩而出,胎兒皮膚和實質(zhì)臟器黃染,羊水渾濁且多為黃色或紫紅色,胎膜表面有糠麩樣物質(zhì)。

2 致病機(jī)制

目前,馬流產(chǎn)沙門氏菌的侵入致病機(jī)制有待深入研究。沙門氏菌感染主要經(jīng)糞-口途徑,不同血清型沙門氏菌在不同宿主環(huán)境中生存和增殖受多種因素影響,包括宿主環(huán)境(pH、溫度和附著部位等)的差異、宿主免疫系統(tǒng)及其對不同血清型的反應(yīng)、宿主體內(nèi)的共生生物以及病原菌本身的遺傳學(xué)特性等[10]。當(dāng)沙門氏菌污染物被機(jī)體攝入后,必須能在胃內(nèi)酸性環(huán)境中存活并通過消化系統(tǒng)進(jìn)入胃腸道器官,在腸道內(nèi)與腸道菌群競爭,到達(dá)并穿過腸黏液層,定殖于腸上皮細(xì)胞[11]。當(dāng)侵入腸上皮細(xì)胞黏膜之后,沙門氏菌可進(jìn)入血液并感染其他器官系統(tǒng),導(dǎo)致嚴(yán)重的革蘭氏陰性敗血癥癥狀,如發(fā)熱、白細(xì)胞減少、血凝障礙、乳酸中毒、葡萄糖和氨基酸代謝紊亂、腹瀉等,使動物機(jī)體體液失衡,進(jìn)而導(dǎo)致動物機(jī)體狀況迅速惡化[12]。沙門氏菌的致病性是由毒力島毒力因子、質(zhì)粒毒力因子、結(jié)構(gòu)性毒力因子(包括菌毛和鞭毛)、內(nèi)毒素毒力因子等參與并相互作用所致,因此,了解毒力因子在沙門氏菌感染致病過程中所發(fā)揮的作用,對開展馬流產(chǎn)沙門氏菌對馬屬動物致病機(jī)制研究具有重要參考意義。

2.1 毒力島毒力因子

沙門氏菌毒力島(Salmonellapathogenicity island,SPI)是一段含有毒力相關(guān)基因的、不穩(wěn)定的位于染色體上的DNA片段,大小為10 kb～100 kb,能編碼多種毒力蛋白,協(xié)同調(diào)控沙門氏菌的入侵和感染,從而增強(qiáng)其致病力。目前,沙門氏菌含有20多個SPI,大多數(shù)血清型中存在SPI-1至SPI-5[13]。其中SPI-1和SPI-2含有大量與細(xì)胞內(nèi)發(fā)病機(jī)制相關(guān)的毒力基因,共同編碼Ⅲ型分泌系統(tǒng)(type Ⅲ secretion sysem,T3SS),同時與沙門氏菌持續(xù)性感染密切相關(guān)[14-15]。SPI-1遺傳性狀穩(wěn)定,大小為43 kb,含有47個基因,目前在與致病力相關(guān)性研究最多且最為清楚的基因有avrA、iacB、invB、sicA、sicP、sipABC、sptP,通過參與細(xì)菌侵入宿主細(xì)胞引發(fā)腸道炎癥,進(jìn)而誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡,從而影響沙門氏菌的毒力[16];SPI-2大小約為40 kb,含有編碼T3SS相關(guān)蛋白的多個基因,包括結(jié)構(gòu)基因(ssa)、調(diào)控基因(ssr)、伴侶基因(ssc)、效應(yīng)基因(sse)等[17],除邦戈爾沙門氏菌外,所有血清型都含有SPI-2[18],目前在與致病力相關(guān)性研究最多的基因有ssaBE、sscAB、sseLFG、ttr,它們與引發(fā)的宿主全身性感染和在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活及復(fù)制有關(guān),主要參與巨噬細(xì)胞內(nèi)全身感染和復(fù)制;SPI-3大小為17 kb,包含sugR、rhuM、rmbA、misL、fidL、marT、slsA、cigR、mgtB和mgtC共10個基因,主要與在巨噬細(xì)胞的存活和在低鎂環(huán)境中生長相關(guān)[19];SPI-4大小為27 kb,包含SiiA～SiiF等6個主要基因,其中SiiA～SiiD和SiiF基因形成Ⅰ型分泌系統(tǒng)(T1SS),用于分泌黏附素SiiE,利于沙門氏菌黏附在上皮細(xì)胞表面,促進(jìn)沙門氏菌的定植[20]。SPI-5大小為7.6 kb,包含pipA～D、sopB、sig-DE等基因,聚集編碼多種T3SS效應(yīng)蛋白,與在宿主的腸道定植有關(guān)。

國內(nèi)研究人員對馬流產(chǎn)沙門氏菌流行菌株毒力島進(jìn)行了初步研究。朱曼玲[21]在馬流產(chǎn)沙門氏菌AD19菌株中發(fā)現(xiàn)了SPI-1～5、SPI-12～14和C63PI毒力島,其中SPI-1由invA、spaP、spaQ、spaR、spaS、invG、prgH、prgK、invE、invB、invC、spaO、iagB、prgI、prgJ、orgA、sicA、iacP等毒力基因組成,SPI-2由ssaC～ssaU、ssrB、ssrA、sscA、sscB、sseA～sseG、sseJ等毒力基因組成。與此同時,該菌株表現(xiàn)出一個罕見的菌毛基因簇(sste),在腸炎沙門氏菌中,ste簇由6個菌毛基因(steA、steB、steC、steD、steE和steF)組成,在腸道定殖方面發(fā)揮重要作用。孫陽陽[22]等人在對山東某驢場流產(chǎn)胎兒分離獲得7株沙門氏菌SL1～SL7,選取毒力島代表性毒力基因(SPI-1:invA、sip;SPI-2:sseA、ttrA;SPI-3:mgtB、mgtC;SPI-4:ssb、soxSR;SPI-5:sopB、sig-D及菌毛基因fimW)進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,除SL1、SL2、SL3、SL7菌株毒力島SPI-4上的ssb毒力基因未檢出外,7株分離菌均具有沙門氏菌典型毒力基因,雖然分離菌株毒力基因均被檢出,但在后續(xù)小鼠致病性試驗中發(fā)現(xiàn)其致病性并不強(qiáng),因此推斷沙門氏菌毒力基因與致病性強(qiáng)弱無必然聯(lián)系。

2.2 質(zhì)粒毒力因子

沙門氏菌的毒力質(zhì)粒(virulence plasmid)在全身性感染宿主過程中發(fā)揮重要作用,毒力質(zhì)粒的攜帶與特定的血清型有關(guān)。在大量的沙門氏菌血清型中,只有少數(shù)含有血清型特異性毒力質(zhì)粒。目前已報道的攜帶毒力質(zhì)粒的沙門氏菌血清型有鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)、豬霍亂沙門氏菌(Salmonellacholeraesuis)、腸炎沙門氏菌(Salmonellaenteritidis)、雞沙門氏菌(Salmonellagallinarum)、都柏林沙門氏菌(Salmonelladublin)、丙型副傷寒沙門氏菌(SalmonellaparatyphiC)、布利丹沙門氏菌(Salmonellablegdam)、御成門沙門氏菌(Salmonellaonarimon)、仙臺沙門氏菌(Salmonellasendai)、綿羊流產(chǎn)沙門氏菌(Salmonellaabortusovis)等10種[23],操縱子大小為6.8 kb,含有spvR、spvA～spvD5個基因,主要與沙門氏菌血清抗性、黏附與定居、在腸外組織細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞內(nèi)存活和生長等有關(guān)[24]。

2.3 結(jié)構(gòu)性毒力因子

在各種血清型的沙門氏菌基因組中,菌毛編碼基因操縱子廣泛存在,含有5～20種菌毛編碼基因操縱子,依據(jù)其可能的表達(dá)和組裝方式,菌毛主要分為伴侶蛋白-推進(jìn)蛋白途徑類(chaperone-usher pathway)菌毛、成核沉淀途徑類(nucleation-precipitation pathway)菌毛、Ⅳ型菌毛共3種類型[25]。菌毛呈絲狀表面結(jié)構(gòu),利于沙門氏菌對上皮的定殖,在感染過程中,菌毛對宿主的識別、定殖和生物膜的形成至關(guān)重要,被認(rèn)為是介導(dǎo)沙門氏菌與宿主腸上皮相互作用和黏附的主要細(xì)胞器。而鞭毛則具有運動、趨化和誘導(dǎo)免疫的能力,在增強(qiáng)沙門氏菌的定殖和侵襲方面發(fā)揮重要作用[26]。

3 疫苗研究

疫苗對于馬流產(chǎn)沙門氏菌病的防控發(fā)揮了積極重要作用。我國在20世紀(jì)70年代成功研制了弱毒疫苗,然而,由于該病受到的關(guān)注有限,導(dǎo)致疫苗的研究相對滯后。隨著新型佐劑的應(yīng)用與基因工程技術(shù)的完善,國內(nèi)外學(xué)者開展了全菌滅活疫苗與亞單位疫苗研究,旨在為該病的防控提供更為安全、有效的疫苗制劑。

3.1 弱毒疫苗

20世紀(jì)70年代,房曉文等[27]成功研制了馬流產(chǎn)弱毒菌苗(C355株),用馬流產(chǎn)沙門氏菌C77-3強(qiáng)毒株通過含醋酸鉈肉湯培養(yǎng)基傳至355代致弱而成,具有安全性好、毒力穩(wěn)定、免疫力強(qiáng)及起效快等優(yōu)點,肌肉注射200億活菌不會導(dǎo)致流產(chǎn),免疫后14～21 d產(chǎn)生免疫力,以100億活菌劑量免疫懷孕母馬,每年2次,其保護(hù)率可高達(dá)100%;該疫苗的廣泛使用為我國20世紀(jì)防控馬流產(chǎn)沙門氏菌病的發(fā)生流行起到了積極重要作用。童坤周等[4]通過使用鈍感動物雛雞腦內(nèi)接種連續(xù)傳代,再經(jīng)雛雞體內(nèi)與培養(yǎng)基體外連續(xù)交替培養(yǎng)致弱,成功研制了C系(C39)菌株弱毒疫苗,同樣具有安全、穩(wěn)定、高效等優(yōu)點。然而,隨著馬屬動物養(yǎng)殖規(guī)模與模式變遷,市場需求規(guī)模受到嚴(yán)重限制,導(dǎo)致該類疫苗的商品化生產(chǎn)中斷。2018年后,由于馬流產(chǎn)沙門氏菌病的持續(xù)發(fā)生,C355馬流產(chǎn)弱毒疫苗恢復(fù)生產(chǎn)至今并在養(yǎng)殖場使用,繼續(xù)為該病的防控起到了積極重要作用。

3.2 滅活疫苗

全菌滅活疫苗同樣可以用于防控馬流產(chǎn)沙門氏菌引起的流產(chǎn)疫情,在國內(nèi)外均有應(yīng)用研究。Stazi M等[28]制備甲醛滅活氫氧化鋁佐劑自家疫苗免疫母馬,72 h后出現(xiàn)短暫的局部腫脹和頸部僵硬等不良反應(yīng),隨后改進(jìn)利用MontanideTMSeppic IMS1313佐劑制備疫苗,該佐劑是一種液體顆粒,粒徑10～500 nm,為即用型納米佐劑,含有免疫刺激化合物,該佐劑疫苗免疫2次均未引起任何局部不良反應(yīng),且二免后1年內(nèi)母馬沒有再次發(fā)生流產(chǎn)疫情。血清學(xué)檢測數(shù)據(jù)顯示,二免后免疫母馬具有較高水平的體液保護(hù)作用,通過母源抗體對新生馬駒也具有被動免疫保護(hù)力。王曉鈞等[29]、胡哲等[30]分別以馬流產(chǎn)沙門氏菌馬源株、馬流產(chǎn)沙門氏菌驢源株甲醛滅活抗原研制了MONTANIDE ISA35水包油佐劑疫苗,小鼠免疫1次即能免于強(qiáng)毒株攻擊;在本動物馬或驢安全性良好,懷孕動物均未發(fā)生流產(chǎn),馬源株疫苗除個別出現(xiàn)采食下降、腫脹或者體溫短暫升高外,無嚴(yán)重不良反應(yīng);驢源株疫苗通過調(diào)整抗原含量與佐劑使用量,避免了注射部位破潰等嚴(yán)重不良反應(yīng);同時還具有低劑量免疫的優(yōu)點,推薦1年春、秋季各免疫1次,間隔6個月。劉明等[31]以驢源流產(chǎn)沙門氏菌菌株、馬鏈球菌獸疫亞種分離株為疫苗候選菌株,分別制備氫氧化鋁、角鯊烯佐劑驢流產(chǎn)沙門氏菌病-獸疫鏈球菌病二聯(lián)滅活疫苗,免疫Babl/c小鼠并以5倍LD50攻毒,氫氧化鋁佐劑疫苗對2種病原菌的保護(hù)率分別為62.5%和75.0%,角鯊烯佐劑疫苗的保護(hù)率均為100%;使用角鯊烯佐劑二聯(lián)滅活苗免疫驢,針對驢流產(chǎn)沙門氏菌、獸疫鏈球菌血清殺菌效價分別為1∶16(殺菌效率68.99%)和1∶4(殺菌效率65.47%)?？梢?以角鯊烯為佐劑制備的二聯(lián)滅活苗在小鼠、驢體內(nèi)均具有較強(qiáng)的免疫保護(hù)效力,且顯著優(yōu)于氫氧化鋁佐劑疫苗。以上研究表明,滅活疫苗可有效防控馬流產(chǎn)沙門氏菌病的流行,同時,滅活疫苗具有自身的優(yōu)點,包括安全、不發(fā)生毒力返祖等。

3.3 噬菌體“裂解物”疫苗

噬菌體(phage)是感染放線菌、藻類、真菌以及細(xì)菌等微生物的病毒的總稱,在細(xì)菌體內(nèi)增殖到一定階段可對宿主菌產(chǎn)生裂解作用,具有裂解力強(qiáng)、綠色安全、宿主特異等優(yōu)點。噬菌體裂解物是由噬菌體裂解的細(xì)菌片段組成,不改變抗原性,可誘導(dǎo)細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)。Abhishek等[32]利用噬菌體PIZ-SAE-2裂解流產(chǎn)沙門氏菌獲得裂解物,并評價了單純噬菌體裂解物(PL-Plain)和以氫氧化鋁膠為佐劑的噬菌體裂解物(PL-Ad)對流產(chǎn)沙門氏菌SAE-742感染保護(hù)作用;將PL-Plain與PL-Ad分別腹腔注射4～6周齡雌性豚鼠,劑量為25 μL、50 μL和100 μL,均可誘導(dǎo)良好的體液免疫,且兩種裂解物50 μL劑量組間接ELISA抗體滴度均高于100 μL劑量組(文獻(xiàn)作者認(rèn)為100 μL高劑量組可能產(chǎn)生了免疫耐受)和全菌滅活疫苗組,同時,兩種疫苗均誘導(dǎo)產(chǎn)生良好的細(xì)胞免疫,淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化水平顯著高于全菌滅活疫苗組,并以PL-Ad疫苗50 μL劑量組最高;采用脾重量指數(shù)評價免疫保護(hù)效果,兩種疫苗該指數(shù)無差異,顯著低于全菌滅活疫苗組與PBS對照組,說明對豚鼠的保護(hù)效率顯著提高。該研究結(jié)果說明,噬菌體通過裂解方式滅活菌體可能成為一種可行的替代策略,為開發(fā)低劑量使用、安全、有效的裂解物疫苗提供了新的參考。

3.4 亞單位疫苗

基因工程亞單位疫苗具有成本低、安全性好、可制備多聯(lián)多價、適用范圍廣等優(yōu)點。研究表明,當(dāng)沙門氏菌感染時,鞭毛蛋白可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生鞭毛特異性的CD4+/CD8+T細(xì)胞活化及相應(yīng)的體液免疫反應(yīng)[33],FliC(flagellin C)和FljB(flagellin B)基因則分別編碼馬流產(chǎn)沙門氏菌鞭毛蛋白的第1、2相鞭毛抗原。2017年,楊康等[34]克隆馬流產(chǎn)沙門氏菌新疆分離株FliC基因,原核表達(dá)的FliC重組蛋白與弗氏佐劑乳化后制備疫苗,經(jīng)背部皮下多點注射免疫小鼠,免疫劑量為50 μg/0.2 mL,3周后加強(qiáng)免疫,每次免疫后14 d采血,經(jīng)ELISA測定,二免后特異性抗體效價可達(dá)1∶72 900,與對照組差異極顯著,且抗體亞型主要是IgG1,以1 MLD50攻毒,保護(hù)率73%,對照組全部死亡。常建新等[35]克隆馬流產(chǎn)沙門氏菌新疆分離株XJMS-97FljB鞭毛蛋白基因,同樣進(jìn)行原核表達(dá),疫苗制備、小鼠免疫及抗體檢測與文獻(xiàn)[34]相同,二免后14 d血清抗體效價為1∶21 500,以5 MLD50攻毒,保護(hù)率75%,對照組全部死亡。王浩等[36]比較了FliC與FljB原核表達(dá)重組鞭毛蛋白免疫效力,經(jīng)背部皮下多點注射免疫小鼠,劑量為50 μg/只,共免疫2次,間隔14 d,分別在0、14、35、42 d采血,間接ELISA方法測定抗體效價,結(jié)果顯示,兩種蛋白均可誘導(dǎo)產(chǎn)生較高水平的特異性抗體IgG,主要為IgG1亞型,其中FljB免疫組抗體水平高于FliC免疫組,二免后14 d攻毒結(jié)果顯示,FljB免疫組保護(hù)率87.5%,高于FliC免疫組的75%。以上研究結(jié)果均表明,馬流產(chǎn)沙門氏菌第1、2相鞭毛原核表達(dá)重組抗原具有良好的免疫原性,但均不能提供完全保護(hù),因此需要對其他免疫保護(hù)性蛋白展開篩選,挖掘可提供完全保護(hù)或者可與鞭毛蛋白協(xié)同完全保護(hù)的免疫原,從而為新型亞單位疫苗開發(fā)奠定堅實基礎(chǔ)。

4 展望

明確致病機(jī)制、研制高效的疫苗等對于開展馬流產(chǎn)沙門氏菌病的防治具有重要意義。然而,馬流產(chǎn)沙門氏菌致病機(jī)制仍有待深入研究,尤其感染后侵染路徑、如何透過胎盤屏障以及在懷孕中后期大量繁殖的誘因等,為開展科學(xué)防治提供支撐。同時,馬流產(chǎn)沙門氏菌病疫苗的生產(chǎn)或者新獸藥申報因市場規(guī)模原因,無法低成本運營,限制了其開發(fā)應(yīng)用與推廣,這極大的困擾著馬流產(chǎn)沙門氏菌病的防治,如若破局,則需要社會各界的共同關(guān)注和努力,以促進(jìn)馬屬動物產(chǎn)業(yè)的特色發(fā)展。