蔣 輝,彭 聰,湯小朋,李 靖,朱怡平

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,北京100193)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是導(dǎo)致馬跛行、影響其運(yùn)動(dòng)性能的重要疾病之一,大約60%的馬匹跛行與骨關(guān)節(jié)炎有關(guān),其中高達(dá)66%的運(yùn)動(dòng)馬患有骨關(guān)節(jié)炎[1]。據(jù)報(bào)道,在美國(guó)每年平均治療一匹骨關(guān)節(jié)炎患馬需要花費(fèi)3 000～5 000美元,對(duì)馬產(chǎn)業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損耗。

馬骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病過(guò)程不僅會(huì)影響關(guān)節(jié)軟骨,還會(huì)累及整個(gè)關(guān)節(jié),包括軟骨下骨、關(guān)節(jié)韌帶、關(guān)節(jié)囊、滑膜和關(guān)節(jié)周圍組織[2]。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且尚未闡明,越來(lái)越多證據(jù)顯示先天免疫系統(tǒng)在調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)內(nèi)炎性反應(yīng)進(jìn)而導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨損傷的過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。骨關(guān)節(jié)炎目前被視為一種多因素疾病,常見(jiàn)因素包括重復(fù)性關(guān)節(jié)軟骨微損傷、發(fā)育性骨軟骨病、自發(fā)性退行性病變、關(guān)節(jié)感染等[3]。

馬骨關(guān)節(jié)炎尚無(wú)治愈方法,傳統(tǒng)治療主要通過(guò)系統(tǒng)性使用非甾體抗炎藥(nonsteroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDs)和關(guān)節(jié)內(nèi)注射皮質(zhì)類固醇類藥物,傳統(tǒng)藥物治療可以緩解疼痛和炎癥等癥狀,但無(wú)法逆轉(zhuǎn)骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病或修復(fù)受損軟骨結(jié)構(gòu)。另外有研究顯示,針對(duì)馬骨關(guān)節(jié)炎長(zhǎng)期使用皮質(zhì)類固醇類藥物會(huì)抑制M2型巨噬細(xì)胞極化及白介素-10(interleukin-10,IL-10)、前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)等抗炎因子的產(chǎn)生,從而降低機(jī)體固有免疫系統(tǒng)活性、破壞關(guān)節(jié)內(nèi)穩(wěn)態(tài),進(jìn)一步損傷關(guān)節(jié)軟骨[4]。

再生醫(yī)學(xué)(regenerative medicine,RM)是一門新興的、發(fā)展迅速的學(xué)科,具有促進(jìn)細(xì)胞、組織或器官再生修復(fù)、抑制炎性反應(yīng)等作用,在運(yùn)動(dòng)損傷治療中具有巨大潛力[5]。目前常用于治療馬骨關(guān)節(jié)炎的再生醫(yī)學(xué)制劑主要包括間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSC)、富血小板血漿(platelet-rich plasma,PRP)、自體條件血清(autologous serum conditions,ACS)和自體蛋白溶液(autologous protein solution,APS)[6]。

1 再生醫(yī)學(xué)作用機(jī)理和分類

再生醫(yī)學(xué)(RM)的起源可追溯到20世紀(jì)80年代的軟骨再生工程,旨在替換或再生細(xì)胞、組織或器官,以恢復(fù)或建立因疾病、損傷、老齡化及先天缺陷等因素而喪失的正常功能[5]。再生醫(yī)學(xué)根據(jù)不同方法和功能成分主要分為三大類:①組織工程與生物材料;②細(xì)胞與細(xì)胞因子療法;③類器官。再生醫(yī)學(xué)的應(yīng)用通常結(jié)合了多種技術(shù)手段,在組織損傷修復(fù)上不斷突破,有望取代傳統(tǒng)的移植和替代療法[7]。

組織工程和生物材料這種方式是在體外培養(yǎng)并構(gòu)建具有組織形態(tài)及生物特點(diǎn)的生物支架,移植進(jìn)體內(nèi)后可調(diào)節(jié)周圍組織、細(xì)胞等進(jìn)行修復(fù)和再生。細(xì)胞與細(xì)胞因子療法通常是對(duì)組織中有利于抑制炎癥、組織再生的細(xì)胞或細(xì)胞因子等成分進(jìn)行富集或培養(yǎng),再應(yīng)用到體內(nèi)的目標(biāo)部位。干細(xì)胞就是這類方法中的典型代表,具有較強(qiáng)的分化和再生功能,還常與生物遺傳學(xué)、納米技術(shù)等學(xué)科重新整合來(lái)提高應(yīng)用效果,在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)展十分迅速[8]。再生醫(yī)學(xué)之所以具有較強(qiáng)的促進(jìn)組織再生能力,主要是通過(guò)培養(yǎng)自體或異體細(xì)胞、組織或基質(zhì)架構(gòu)等建立起復(fù)雜的生物信號(hào)環(huán)境,其中的分子及細(xì)胞得以根據(jù)周圍環(huán)境釋放不同生物信號(hào),來(lái)建立更為穩(wěn)定健康的生物環(huán)境。當(dāng)在體內(nèi)應(yīng)用這些再生制劑后,將通過(guò)生物信號(hào)調(diào)節(jié)周圍受損組織或細(xì)胞的生物活動(dòng),甚至動(dòng)員體內(nèi)免疫系統(tǒng)的其他成員,共同達(dá)到組織修復(fù)的目的[9]。

目前軟骨組織工程方法已用于局灶性關(guān)節(jié)軟骨缺損的再生,并取得了一定的效果[10]。這種技術(shù)對(duì)于治療骨關(guān)節(jié)炎具有重要意義。在馬臨床治療中,再生醫(yī)學(xué)同樣應(yīng)用廣泛,主要以細(xì)胞及細(xì)胞因子療法為主,常用再生療法包括MSC、PRP、ACS和APS,在過(guò)去10年中已用于治療包括馬骨關(guān)節(jié)炎在內(nèi)的臨床運(yùn)動(dòng)損傷[6]。

2 再生醫(yī)學(xué)制劑在馬骨關(guān)節(jié)炎治療中的應(yīng)用

2.1 自體條件血清在治療馬骨關(guān)節(jié)炎中的應(yīng)用

自體條件血清(ACS)是一種自體血液制品,它由患馬自身血液無(wú)菌孵育后,通過(guò)離心并提取血清組分獲得,是一種無(wú)細(xì)胞產(chǎn)物,富含球蛋白、白蛋白、白介素1受體拮抗劑(interleukin-1 receptor antagonist,IL-1RA)等,可抑制炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng),具有較強(qiáng)抗炎功能[6,11]。

此外,ACS還含有高濃度抗炎細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子(growth factor,GF),例如IL-4、IL-6、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、血小板源生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor,PDGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)等。PDGF、TGF-β1、VEGF等生長(zhǎng)因子都存在于血小板顆粒中,參與調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨代謝和軟骨細(xì)胞表達(dá),有助于組織損傷修復(fù)。

目前,商品化ACS制劑是白介素受體拮抗劑蛋白(interleukin receptor antagonist protein,IRAP),在一項(xiàng)關(guān)于馬血IRAP蛋白質(zhì)譜的檢測(cè)中,發(fā)現(xiàn)應(yīng)用IRAP的樣本中檢測(cè)的細(xì)胞因子水平均高于對(duì)照組,其中IL-1RA和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平顯著升高,表明IRAP具有良好的抗炎效果[12]。在實(shí)際應(yīng)用中,由于ACS中的無(wú)細(xì)胞成分,也便于儲(chǔ)存和運(yùn)輸[6]。

在一項(xiàng)臨床研究中,顯示應(yīng)用ACS的馬匹在治療5周后其骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)跛行癥狀顯著改善,并且在治療后10周滑膜增生明顯減少[13]。盡管有證據(jù)顯示ACS可顯著緩解馬骨關(guān)節(jié)炎臨床癥狀并改善組織學(xué)表現(xiàn),但由于ACS細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子含量存在較大的個(gè)體差異,使得ACS在一些骨關(guān)節(jié)炎治療實(shí)驗(yàn)中效果并不明顯[6],所以進(jìn)一步進(jìn)行ACS臨床評(píng)估以了解其細(xì)胞因子譜效果十分必要。

2.2 富血小板血漿在治療馬骨關(guān)節(jié)炎中的應(yīng)用

富血小板血漿(PRP)是通過(guò)離心富集血液中血小板成分后得到的生物制劑。它的生產(chǎn)成本相對(duì)較低,可以較容易地從全血中分離出來(lái),因其富含對(duì)傷口愈合至關(guān)重要的PDGF-BB、胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin-like growth factor,IGF)、TGF-β1等而被用于促進(jìn)損傷修復(fù)。

PRP具有復(fù)雜的生物活性微環(huán)境,除血漿中的細(xì)胞因子、凝血素、GF外,血小板脫顆?？舍尫蓬~外的GF,與一系列關(guān)鍵的組織愈合機(jī)制有關(guān)[14]。其中PDGF-BB和TGF-β1可促進(jìn)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生和滑膜細(xì)胞的分化,緩解關(guān)節(jié)炎癥和疼痛,并對(duì)關(guān)節(jié)滑膜和軟骨具有促合成代謝、抗炎作用[15]。

在一項(xiàng)應(yīng)用PRP治療馬匹肌腱損傷的研究中,結(jié)果顯示由于PRP的纖維基質(zhì)重塑作用,短期內(nèi)使用PRP可促進(jìn)修復(fù)組織、改善跛行。長(zhǎng)期來(lái)看,使用PRP治療肌腱損傷有利于馬恢復(fù)到正常的運(yùn)動(dòng)水平[16]。在目前PRP治療馬骨關(guān)節(jié)炎的相關(guān)研究中,大多數(shù)研究顯示PRP有較好治療效果。研究顯示,PRP可以通過(guò)刺激軟骨細(xì)胞增殖、蛋白多糖合成和Ⅱ型膠原的胞外基質(zhì)合成,促進(jìn)軟骨組織修復(fù)。PRP還具有保護(hù)軟骨作用,其能促進(jìn)滑膜細(xì)胞透明質(zhì)酸的合成、分泌以及抑制軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)[17]。將PRP注射到馬匹骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)后,馬的跛行程度、運(yùn)動(dòng)范圍和步態(tài)均有顯著改善[17]。由于目前關(guān)于PRP制備技術(shù)和PRP治療方案尚未統(tǒng)一,導(dǎo)致不同試驗(yàn)中得到的PRP治療效果存在較大差異。因此,標(biāo)準(zhǔn)化PRP制備方案及治療方案仍值得進(jìn)一步探究。

2.3 自體蛋白溶液在治療馬骨關(guān)節(jié)炎中的應(yīng)用

自體蛋白溶液(APS)是一種濃縮血小板和抗炎細(xì)胞因子的制劑。它由富血小板血漿濃縮而成,通過(guò)兩步離心法濃縮血小板、生長(zhǎng)因子和抗炎細(xì)胞因子而成。與全血相比,含有更少紅細(xì)胞的同時(shí),APS含有明顯更多白細(xì)胞(white blood cell,WBC)、血小板。有試驗(yàn)表明,APS通過(guò)白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)靶向介導(dǎo)的炎癥通路來(lái)治療骨關(guān)節(jié)炎,通過(guò)關(guān)節(jié)內(nèi)注射APS可以有效減輕疼痛并減緩骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展[18]。

骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病過(guò)程中,炎性因子IL-1和TNF-α是介導(dǎo)炎性反應(yīng)、組織損傷的主要角色,而APS中含有多種抗炎因子,包括IL-1RA及TNF-α的Ⅰ型、Ⅱ型可溶性受體,即腫瘤壞死因子受體Ⅰ(tumor necrosis factor receptor Ⅰ,TNF-RⅠ)、腫瘤壞死因子受體Ⅱ(tumor necrosis factor receptor Ⅱ,TNF-RⅡ)來(lái)緩解炎性反應(yīng)。在一項(xiàng)研究中,應(yīng)用APS治療自然發(fā)生骨關(guān)節(jié)炎的馬14天后,馬跛行、屈曲疼痛的癥狀顯著改善。與對(duì)照組相比,接受APS(IL-1RA/IL-1>1 000)治療的馬匹關(guān)節(jié)液蛋白質(zhì)濃度顯著降低,臨床治療效果良好[19]。在另一項(xiàng)研究中,APS治療骨關(guān)節(jié)炎患馬12周和52周后,其基于美國(guó)馬獸醫(yī)協(xié)會(huì)(American Association of Equine Practitioners,AAEP)的跛行評(píng)分和舒適度有顯著提升,治療后患馬無(wú)進(jìn)一步骨贅和軟骨下硬化的影像學(xué)病變形成,無(wú)關(guān)節(jié)間隙狹窄情況[17]?？偟膩?lái)說(shuō),APS由于其豐富的抗炎成分可促進(jìn)關(guān)節(jié)組織的合成代謝、緩解炎性反應(yīng),是用于治療骨關(guān)節(jié)炎的重要療法之一[20]。

與ACS相比,APS的生產(chǎn)不需要24 h的孵育期,在治療效率方面存在優(yōu)勢(shì)。與不含血小板等細(xì)胞成分的ACS相比,APS中的PDGF等抗炎因子在減少軟骨細(xì)胞炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)方面具有較好效果[21]。另外有研究顯示,APS中的TGF-β濃度顯著高于ACS,而IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α等細(xì)胞因子與ACS濃度相似[21]。從目前的研究結(jié)果來(lái)看,單次關(guān)節(jié)內(nèi)注射APS是治療早期骨關(guān)節(jié)炎的一種有效療法。但目前對(duì)于ACS的討論大部分限于體外研究,在其臨床治療效果方面還需要更多研究[18]。

2.4 間充質(zhì)干細(xì)胞在治療馬骨關(guān)節(jié)炎中的應(yīng)用

間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)具有一定自我更新能力,能在體外分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和軟骨母細(xì)胞等多種組織細(xì)胞。在馬骨關(guān)節(jié)炎治療中,MSC可從多種組織獲得(例如骨髓、脂肪、外周血、臍帶血、關(guān)節(jié)滑膜等),且增殖迅速并能在體外反復(fù)傳代后仍保持分化潛能,還具有低免疫排異反應(yīng)、在宿主體內(nèi)長(zhǎng)期共存等特點(diǎn)[22]。

MSC在抑制馬骨關(guān)節(jié)炎炎癥和緩解疼痛方面起到關(guān)鍵作用。一方面,它可通過(guò)巨噬細(xì)胞和輔助T細(xì)胞調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫系統(tǒng)和先天免疫系統(tǒng)中的其他細(xì)胞。另一方面,MSC可通過(guò)許多趨化因子和抗炎細(xì)胞因子進(jìn)行細(xì)胞間通訊,或通過(guò)生物活性物質(zhì)(如IL-6、IL-10和TGF-β)來(lái)調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)。TGF-β具有一定促軟骨細(xì)胞分化能力,在關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[22]。也有研究表明,MSC通過(guò)減少調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(Treg)復(fù)制、募集和轉(zhuǎn)化來(lái)提升促炎活性,并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。且在一些MSC應(yīng)用于馬軟組織損傷模型的研究中,證明了MSC具有較低免疫原性,同種異體應(yīng)用MSC具有良好的安全性和有效性[23]。

MSC在馬骨關(guān)節(jié)炎治療中有改善局部軟骨微環(huán)境和新陳代謝的作用。在一項(xiàng)臨床前研究中,MSC治療組的馬骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)在跛行檢查中顯示出7周后,其基于AAEP跛行評(píng)分顯著低于對(duì)照組,關(guān)節(jié)檢查結(jié)果顯示關(guān)節(jié)積液減少,滑液粘度提高,尸檢過(guò)程中發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)改善,表現(xiàn)出良好的馬骨關(guān)節(jié)炎治療效果[24]。但目前認(rèn)為,MSC用于治療早期骨關(guān)節(jié)炎效果更好,可促進(jìn)纖維軟骨再生,當(dāng)骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展到一定程度后更多的是發(fā)揮抑制炎性、緩解疼痛等效果[25]。

MSC來(lái)源豐富,對(duì)于馬骨關(guān)節(jié)炎的治療最有價(jià)值和最可靠的MSC來(lái)源仍然存在爭(zhēng)議。骨髓和脂肪來(lái)源的干細(xì)胞是最常見(jiàn)的干細(xì)胞來(lái)源,但圍產(chǎn)期組織例如臍帶血、臍帶組織、羊膜或羊水來(lái)源的MSC也越來(lái)越常見(jiàn)。臍帶血干細(xì)胞(umbilical cord mesenchymal stem cell,UCMSC)目前被認(rèn)為是MSC的最佳來(lái)源,它的獲取不涉及侵入性操作,符合動(dòng)物福利,且有研究表明UCMSC具有更強(qiáng)的增殖能力和免疫調(diào)節(jié)能力[26]。一項(xiàng)研究已表明異源馬UCMSC(EUC-MSCs)可通過(guò)免疫調(diào)節(jié)的作用機(jī)制,緩解骨關(guān)節(jié)炎患馬的跛行癥狀和疼痛、減緩骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展、促進(jìn)組織再生,并具有良好的使用安全性。因此,EUC-MSCs可能是未來(lái)治療馬骨關(guān)節(jié)炎一種很好的選擇。

由于MSC軟骨形成潛能和免疫抑制特性,其有望成為治療骨關(guān)節(jié)炎的新興療法。然而,用于治療重度或全身性骨關(guān)節(jié)炎時(shí)MSC的最佳劑量或治療方案、以及自體或同種異體MSC的安全性和有效性方面還需更多研究驗(yàn)證[27]。目前,內(nèi)源性滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞的擴(kuò)增以及提高同種異體骨髓間MSC治療效果是骨關(guān)節(jié)炎再生醫(yī)學(xué)中的研究重點(diǎn)[23]。

3 展望

再生醫(yī)學(xué)的效果盡管在多個(gè)試驗(yàn)、臨床前研究、病例報(bào)告和對(duì)照研究中取得了良好的結(jié)果,但仍需更多設(shè)計(jì)嚴(yán)謹(jǐn)、試驗(yàn)對(duì)象數(shù)量充足的研究證明其臨床應(yīng)用效果。此外,再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域還面臨著幾個(gè)挑戰(zhàn),如缺乏明確的細(xì)胞或生物活性成分來(lái)源作為治療手段,再生醫(yī)學(xué)制劑的作用機(jī)制尚不明確等。再生醫(yī)學(xué)方面研究還需進(jìn)一步規(guī)范不同類型再生制劑的制備及應(yīng)用規(guī)范,明確發(fā)揮作用成分及機(jī)制,以便進(jìn)一步發(fā)揮其抑制炎癥、組織修復(fù)等作用。例如,標(biāo)化馬ACS孵育時(shí)間和條件來(lái)研究其對(duì)骨關(guān)節(jié)炎模型中細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子含量和濃度的影響;規(guī)定馬PRP制備和治療骨關(guān)節(jié)炎方案來(lái)研究其治療機(jī)制和效果;進(jìn)一步探究APS在馬骨關(guān)節(jié)炎不同階段細(xì)胞因子發(fā)揮的作用機(jī)制;研究MSC免疫調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路以提高骨關(guān)節(jié)炎治療效果。綜上所述,再生醫(yī)學(xué)治療骨關(guān)節(jié)炎仍是如今馬運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)中的研究重點(diǎn),未來(lái)還需更多深入研究繼續(xù)挖掘再生醫(yī)學(xué)的應(yīng)用潛力。