付 濤,謝 娟,韓 偉,黃國寧,武麗紅*,楊振山

(1.重慶市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心,重慶 400013;2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬婦女兒童醫(yī)院,重慶 401147;3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,廣東廣州 510642)

子宮肌瘤(Uterine fibroids)是子宮肌層的良性腫瘤,主要發(fā)生在育齡期和絕經(jīng)期后的婦女[1-2]。目前子宮肌瘤的病因尚未完全明確,遺傳因素改變、性激素水平異常等都有可能導(dǎo)致子宮肌瘤的發(fā)生。在動物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究中,實驗動物模型作為驗證臨床假說和實驗假說的基礎(chǔ),能夠幫助人們高效地認識疾病的病因機理,以及進行藥物的研發(fā)和評估[3]。動物模型的應(yīng)用使科研人員更加全面地認識疾病的本質(zhì)。然而,國內(nèi)外對子宮肌瘤的動物模型尚無統(tǒng)一的標準。因此,本文綜述了子宮肌瘤的相關(guān)致病因素以及國內(nèi)外研究人員所使用的子宮肌瘤自發(fā)性動物模型、誘發(fā)性動物模型、異種移植動物模型以及基因工程動物模型,并分析各種模型的優(yōu)缺點和適用性,以期為該領(lǐng)域研究人員開展研究提供參考。

1 子宮肌瘤的病因

1.1 遺傳因素

子宮肌瘤的發(fā)生可能與遺傳因素有關(guān)。通過全基因組測序檢測子宮肌瘤中的基因序列,結(jié)果表明大多數(shù)的子宮肌瘤組織中存在中介體復(fù)合物亞基12(mediator complex subunit 12,MED12)基因突變[4]。MED12基因的突變使得其蛋白構(gòu)象發(fā)生改變,從而影響通過激酶介導(dǎo)的對子宮肌層干細胞命運的調(diào)控,導(dǎo)致子宮肌瘤的發(fā)生。此外還有證據(jù)揭示高遷移率族蛋白A2(high-mobility group AT-hook 2,HMGA2)在子宮肌瘤中表達顯著增高,HMGA2可能通過激活PLAG1(pleomorphic adenoma gene 1)來促進子宮肌瘤的發(fā)生[5]。

1.2 性激素因素

子宮肌瘤被認為是雌激素依賴性的腫瘤,因為其主要發(fā)生于雌激素分泌旺盛的育齡期女性。當女性絕經(jīng)后子宮肌瘤停止發(fā)展或者縮小[2]。子宮肌瘤組織中的雌激素水平明顯高于周圍非肌瘤組織。此外,子宮肌瘤細胞中雌激素受體的表達水平也高于正常子宮平滑肌細胞。王玉玲等[6]的臨床研究表明,子宮肌瘤局部存在大量雌激素與孕酮激素受體,其發(fā)生發(fā)展和局部雌激素、孕酮激素以及相應(yīng)受體的含量密切相關(guān)。雌激素受體和信號通路的異常導(dǎo)致子宮肌瘤的發(fā)生發(fā)展[7]。

1.3 其他因素

飲食習(xí)慣變化也可能引起子宮肌瘤的發(fā)生。研究表明大量食用蔬菜和水果的女性,患子宮肌瘤的可能性顯著降低[8]。大量飲酒與子宮肌瘤患病風(fēng)險呈正相關(guān)[9]。飲食習(xí)慣的改變可能會影響婦女體內(nèi)類固醇激素水平,在一定程度上導(dǎo)致子宮肌瘤的發(fā)生。

中醫(yī)辯證認為,肝郁氣滯、沖任氣血受損、經(jīng)產(chǎn)調(diào)攝不當、臟腑虛弱、飲食不節(jié)是造成子宮肌瘤疾病的主要原因。腎陰陽失調(diào)、痰瘀互結(jié),病位兼肝、脾、腎三臟是主要病機[10]。

2 子宮肌瘤動物模型

2.1 自發(fā)性動物模型

自發(fā)性子宮肌瘤動物模型是一種未經(jīng)人為干預(yù)的特定品系的實驗動物,其生長過程中自發(fā)產(chǎn)生子宮肌瘤。代表動物有Eker大鼠,日本鵪鶉,大肚豬等。其中,Eker大鼠存在結(jié)節(jié)性硬化癥2基因(tuberous sclerosis complex 2,Tsc2)突變,在3～4月齡后約有65%的概率自發(fā)形成子宮肌瘤而被國外學(xué)者廣泛使用。利用該模型研究人員陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了一些潛在的用于預(yù)防和治療子宮肌瘤的藥物。例如,維生素D3(vitamin D3)被證明可以降低患子宮肌瘤的風(fēng)險[11],色素上皮衍生因子(pigment epithelium derived factor,PEDF)能夠顯著抑制肌瘤的生長速度[12],兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(Ro41-0960)能夠通過促進2-羥基雌激素的積累來引起細胞凋亡,從而阻止子宮肌瘤生長[13]。Eker大鼠目前主要應(yīng)用于研究內(nèi)分泌干擾物暴露對子宮肌瘤發(fā)病的影響。然而,其作為子宮肌瘤動物模型也存在一些局限性。首先與人類疾病相比,該動物模型的子宮肌瘤組織中含有的膠原結(jié)締組織間質(zhì)較少,其次Eker大鼠會同時產(chǎn)生良性和惡性的平滑肌腫瘤。這些問題影響了所得結(jié)論的有效性。

自發(fā)性動物模型具有不需要人工干預(yù)以及其病理特征與人類相似的優(yōu)點,但該類動物模型在使用上也存在一些限制。這些模型價格較高,造模周期較長,并且還可能受到其他因素的干擾,影響實驗結(jié)果的可靠性。

2.2 誘發(fā)性動物模型

單一雌激素造模和雌激素孕酮激素聯(lián)合造模是兩種常用的建立誘發(fā)性子宮肌瘤動物模型的方法。一般采用大鼠來建立模型。在單一雌激素造模中,給予動物高劑量的雌激素,如己烯雌酚,可以誘發(fā)子宮肌瘤的形成。香衛(wèi)紅等[14]通過給大鼠隔日肌注己烯雌酚40 μg/只,進行9周,成功建立模型。在這之后,陳海剛等[15]給性成熟的雌性大鼠連續(xù)8周每周注射兩次200 μg雌激素,形成與人相似的子宮肌瘤。該模型大鼠血清雌激素水平顯著升高,且肌瘤組織中雌激素受體和孕激素受體表達顯著增強,可用于子宮肌瘤的后續(xù)研究。

另一種常用的方法是雌激素孕酮激素聯(lián)合造模。在這種方法中,將動物暴露于雌激素和孕酮的聯(lián)合作用下,誘發(fā)子宮肌瘤的形成。張曉敏等[16]采用腹腔注射的方法每天給SD大鼠注射苯甲酸雌二醇0.5 mg/kg,同時每周注射1次孕酮4 mg/kg,連續(xù)注射25 d。之后,同時注射苯甲酸雌二醇和孕酮連續(xù)5 d。造模結(jié)束后,大鼠子宮重量和子宮系數(shù)顯著增加,子宮平滑肌組織出現(xiàn)局灶性和多發(fā)性增生,血清中腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor α,TNF-α)水平顯著升高,提示造模成功。王芳芳[17]等延長了前期雌激素的注射時間,先給SD大鼠每天腹腔注射苯甲酸雌二醇0.5 mg/kg,持續(xù)30 d。同時每周注射1次黃體酮4 mg/kg后,連續(xù)注射2種激素5 d。通過檢測子宮濕重、子宮系數(shù)、病理切片染色等指標后判斷模型建立成功。相較于單一雌激素造模,雌激素孕酮激素聯(lián)合造模更穩(wěn)定,成功率更高,而且更加符合子宮肌瘤發(fā)生、發(fā)展的過程,是目前國內(nèi)研究人員主要采取的子宮肌瘤造模方法[18]。

相較于上述短期造模,長期造模方法也在誘發(fā)性子宮肌瘤動物模型的建立中被廣泛應(yīng)用。韓云霞等[19]采用連續(xù)10周隔日肌注己烯雌酚0.04 mg/只,在此期間給SD大鼠肌注每周注射1次黃體酮,1 mg/只。該方法使大鼠血清中雌二醇以及孕酮水平顯著升高,子宮重量增加,子宮系數(shù)增大,成功建立模型。類似的,霍安妮等[20]先給SD大鼠肌注0.5 mg/kg的苯甲酸雌二醇,每周3次,進行12周。然后繼續(xù)肌注5 mg/kg的黃體酮,每周2次,進行4周。隨后的形態(tài)學(xué)與病理學(xué)檢查表明造模成功。

誘發(fā)性子宮肌瘤動物模型能夠更好的模擬人子宮肌瘤的生成過程,并具有價格低廉,易于重復(fù)的優(yōu)點,這些模型被廣泛被用于研究子宮肌瘤的病理生理機制以及評估潛在的治療方法。通過該模型,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些潛在的治療子宮肌瘤的藥物,如長托寧[16]、紫草素[17]、香虎清婦炎顆粒[19]、丹參注射液[20]等,這些藥物能顯著抑制子宮肌瘤的增長。然而,對于誘發(fā)性子宮肌瘤動物模型的造模方法,如激素選擇、給藥方法、頻率和周期等尚未形成共識。因此仍需要對該方法做進一步的優(yōu)化與探究。此外,需要進一步研究這些模型與人類子宮肌瘤的相似性,并驗證通過動物模型得出的治療方法在臨床上的有效性和安全性。

2.3 異種移植動物模型

子宮肌瘤異種移植模型是將組織或細胞移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)來建立的模型。Hassan M H等[21]用預(yù)先轉(zhuǎn)染腺病毒環(huán)氧化酶2(cyclooxygenase-2,Cox2)和腺病毒血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor-A,VEGF-A)的人子宮肌瘤組織植入到嚴重聯(lián)合免疫缺陷(severe combined immunodeficient,SCID)小鼠皮下,移植的組織塊在小鼠體內(nèi)持續(xù)生長30 d。研究發(fā)現(xiàn)移植的組織與原始患者組織在增殖和凋亡的細胞數(shù)量,平滑肌肌動蛋白、結(jié)蛋白、波形蛋白、雌激素受體和孕激素受體的表達上相似,表明模型構(gòu)建成功。Ishikawa H等[22]將人的子宮肌瘤組織移植到切過卵巢的免疫缺陷小鼠的腎包膜下,并向其體內(nèi)埋植了釋放雌激素和孕酮的緩釋小球。在雌激素和孕酮的作用下,移植的平滑肌瘤組織不斷增大,建立了能夠反映子宮肌瘤特征的移植模型。Suzuki Y等[23]在BALB/c裸鼠背部皮膚下移植人子宮肌瘤組織,同時皮下植入雌激素和孕酮的緩釋顆粒。試驗結(jié)果表明移植的子宮肌瘤組織在裸鼠體內(nèi)能夠生長,并改變其原始分布。

相較于組織移植造模,細胞移植造模具有操作簡單,樣品來源單一,消除了組織移植必須要從臨床上獲取新鮮子宮肌瘤組織樣品的限制等優(yōu)點。在子宮肌瘤研究中,細胞移植模型也被廣泛應(yīng)用。Drosch M等[24]將人子宮肌瘤來源的細胞注射到有免疫缺陷的Scid/beige小鼠肌層中,形成在組織學(xué)上與人子宮肌瘤相似的移植模型。這種模型無需對原代細胞進行遺傳修飾,適合研究子宮肌瘤的致病機制。Chen H Y等[25]通過給Foxn1裸鼠皮下注射預(yù)先轉(zhuǎn)染熒光素酶的Eker大鼠來源的子宮肌瘤細胞來建立模型。應(yīng)用該模型發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇具有治療子宮肌瘤的潛力,其能顯著抑制子宮肌瘤的增長并降低細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)蛋白的表達。近年來,隨著三維細胞培養(yǎng)方法的發(fā)展,研究人員還將三維細胞培養(yǎng)方法應(yīng)用于子宮肌瘤的細胞移植模型:通過將永生化子宮肌瘤細胞接種到基質(zhì)膠中形成三維細胞培養(yǎng)體系。再將其移植到預(yù)先切除卵巢的NOD/SCID小鼠皮下,同時皮下埋植雌激素和孕酮緩釋裝置來構(gòu)建動物模型,此方法建模成功率大于90%[26]。Malik M等[27]利用此模型發(fā)現(xiàn)姜黃素能作為預(yù)防和治療子宮肌瘤的潛在藥物來抑制子宮肌瘤的生長。盡管異種移植動物模型具有造模成功率高且更能反應(yīng)人類疾病情況的優(yōu)點,但也存在一些限制。免疫缺陷小鼠價格昂貴,對其生活環(huán)境的無菌要求較高,因此對研究人員的實驗條件較為苛刻。

2.4 基因工程動物模型

隨著生物科學(xué)的發(fā)展進步,基因工程技術(shù)為人們研究子宮肌瘤提供了新的手段。研究人員通過將外源DNA片段導(dǎo)入受精卵或者利用人工構(gòu)建的特異性核酸酶對目標基因序列進行精準編輯,從而產(chǎn)生具有穩(wěn)定遺傳的可用于研究子宮肌瘤疾病的動物模型。MED12基因的突變被證明與子宮肌瘤有很強的相關(guān)性。Mittal P等[28]將帶有FLAG標簽的單堿基突變(c.131G>A)的Med12基因整合到常染色體ROSA26基因組位點上,構(gòu)建了條件性敲除(Amhr2-Cre)子宮間充質(zhì)細胞中Med12基因并表達Med12(c.131G>A)錯義突變基因的小鼠。研究結(jié)果顯示,這些小鼠出現(xiàn)廣泛的子宮肌瘤癥狀,并且在12周齡后,80%的子宮內(nèi)病變與子宮肌瘤一致。表明MED12基因的突變導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定是導(dǎo)致人子宮肌瘤的主要原因之一。

基于Eker大鼠模型,Tsc2基因缺失被認為是子宮肌瘤病因的重要分子機制。Prizant H等[29]使用子宮特異性敲除(Pgr-Cre)Tsc2基因的小鼠發(fā)現(xiàn),在12周齡時幾乎100%的條件敲除雌鼠發(fā)生子宮肌層增生,在24周齡時發(fā)生子宮肌瘤。他們還發(fā)現(xiàn),利用哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1(mammalian target of rapamycin complex 1,mTORC1)抑制劑雷帕霉素可以抑制敲除鼠子宮的生長異常。此外在小鼠子宮肌層中過表達PI3K/Akt-mTOR上游基因Gpr10(G-protein-coupled receptor 10)會導(dǎo)致子宮肌層增生,表現(xiàn)出人子宮肌瘤的分子特征[30]。通過基因工程技術(shù),研究人員可以精確的模擬人類子宮肌瘤中的基因突變,并研究這些突變對疾病發(fā)展的影響?；蚬こ虅游锬Ｐ途哂刑禺愋詮?能夠更有效、直接地研究相關(guān)基因?qū)ψ訉m肌瘤影響的優(yōu)點。然而構(gòu)建這些模型所需的技術(shù)要求高、流程繁瑣、效率較低、而且價格昂貴。對現(xiàn)有子宮肌瘤動物模型的相關(guān)總結(jié)見表1。

表1 現(xiàn)有子宮肌瘤動物模型分析

3 總結(jié)與展望

子宮肌瘤是育齡女性常發(fā)的腫瘤疾病,對患者的健康和生殖生育能力產(chǎn)生負面影響。盡管子宮肌瘤的具體病因機制沒有得到完全證實,但目前的研究認為其發(fā)生、發(fā)展涉及遺傳、性激素水平異常等眾多因素。需要強調(diào)的是,子宮肌瘤的發(fā)生不是一種單獨因素就能決定,而是由眾多因素相互作用所致,這其中涉及許多分子機制。子宮肌瘤動物模型的建立為進一步研究子宮肌瘤的致病分子機理以及治療方案提供了有效途徑。

通過總結(jié)國內(nèi)外子宮肌瘤動物模型研究進展,發(fā)現(xiàn)目前國外子宮肌瘤動物模型多采用自發(fā)性免疫缺陷Eker大鼠來建立,該模型近年來被廣泛應(yīng)用于研究內(nèi)分泌干擾物暴露對子宮肌瘤發(fā)病的影響。然而,該模型在國內(nèi)較難購買以及建模周期較長,限制其在國內(nèi)的應(yīng)用。目前國內(nèi)科研人員主要通過外源性雌激素、孕酮激素聯(lián)合誘導(dǎo)子宮肌瘤模型的建立。與單一雌激素模型相比,雌激素孕酮激素聯(lián)合誘導(dǎo)模型具有較高的可靠性和穩(wěn)定性,并與子宮肌瘤的病因和發(fā)病機理有一定的關(guān)聯(lián),更加適合于臨床實驗研究,以評估某些藥物的藥理和治療作用。然而,選擇適合的模型仍然取決于具體的研究目的和需求。

基因工程動物模型的發(fā)展為科學(xué)工作者研究提供了新的方法和手段。通過構(gòu)建目標基因的條件敲除鼠,研究人員可以更深入的探究子宮肌瘤的相關(guān)分子機制以及評價對應(yīng)藥物的治療效果。結(jié)合近年來飛速發(fā)展的類器官、單細胞測序以及空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù),為子宮肌瘤模型研究提供新的方向。這些有望推動子宮肌瘤的預(yù)防、診斷以及治療領(lǐng)域的發(fā)展,為尋找新的治療靶點和開發(fā)個體化治療方案提供新途徑。