摘 要：【目的】研究靈武長棗根蘗繁殖與嫁接繁殖果實(shí)品質(zhì)差異的內(nèi)在機(jī)理，為提高其果實(shí)品質(zhì)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。【方法】以靈武長棗根蘗繁殖與嫁接繁殖白熟期（NB）、著色期（NZ）、成熟期（NC）和嫁接繁殖白熟期（JB）、著色期（JZ）、成熟期（JC）的果實(shí)為試驗(yàn)材料，采用高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行果實(shí)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，篩選與根蘗和嫁接繁殖的靈武長棗果實(shí)品質(zhì)差異相關(guān)的基因，初步探究根蘗和嫁接繁殖靈武長棗果實(shí)不同時(shí)期基因表達(dá)差異情況。【結(jié)果】18個(gè)靈武長棗樣品經(jīng)過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，得到質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)138.26 GB，將其比對(duì)到參考基因組冬棗上，18個(gè)樣品的Cleans reads與參考基因組比對(duì)效率在93.77%以上。主成分分析結(jié)果顯示，3次生物學(xué)重復(fù)樣品聚集程度較高且組間存在分離現(xiàn)象，說明其基因表達(dá)量存在差異。差異分析結(jié)果表明，靈武長棗果實(shí)發(fā)育各時(shí)期組間分析對(duì)比中，果實(shí)白熟期（JB-vs-NB）、著色期（JZ-vs-NZ）和成熟期（JC-vs-NC）各組間分別篩選出65、4 509和1 534個(gè)差異基因。GO功能富集到生物過程、分子功能和細(xì)胞組分三大類中的50個(gè)亞類中，KEGG通路注釋將差異基因顯著富集在次生代謝物生物合成、代謝途徑、氨基酸生物合成等通路中，成熟期差異基因富集在糖酸相關(guān)通路的顯著性較高。【結(jié)論】在淀粉和蔗糖代謝、半乳糖代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝，乙醛酸和二羧酸代謝、丁酸代謝5條與果實(shí)可溶性糖和總酸含量相關(guān)的代謝途徑中篩選出了ncbi_107424266、ncbi_107414286、ncbi_107425230、ncbi_107429837等31個(gè)差異基因，分別在果實(shí)發(fā)育不同時(shí)期的糖酸代謝途徑中差異表達(dá)，調(diào)控各時(shí)期果實(shí)中可溶性糖及總酸含量。

關(guān)鍵詞：靈武長棗；根蘗繁殖；嫁接繁殖；差異基因

中圖分類號(hào)：S727.3；S793.9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-923X（2024）06-0030-13

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（32060338）。

Differential gene expression analysis of Lingwuchangzao jujube fruit at different stages of root tiller and grafting reproduction

YANG Rong1， LIU Jiajia1， LI Xueni1， YU Ruili2， MA Yuan1

（1. College of Forestry and Prataculture， Ningxia University， Yinchuan 750021， Ningxia， China； 2. Ningxia Wolfberry Industry Development Center， Yinchuan 750000， Ningxia， China）

Abstract：【Objective】The differences in the internal mechanism of fruit quality between root tiller reproduction and grafting reproduction of ‘Lingwuchangzao’ jujube were studied to provide basic research for improving its fruit quality.【Method】The fruits of‘Lingwuchangzao’ jujube root tiller reproduction and grafting reproduction at white maturity stage （NB）， coloring stage （NZ）， maturity stage （NC） and grafting reproduction at white maturity stage （JB）， coloring stage （JZ） and maturity stage （JC） were used as experimental materials. High-throughput sequencing technology was used to sequence the fruit transcriptome. The differential genes related to the quality difference of ‘Lingwuchangzao’ jujube fruit of root tiller and grafting reproduction were screened， and the gene expression differences of the fruit of root tiller and grafting reproduction at different stages were preliminarily explored.【Result】The 18‘Lingwuchangzao’ jujube samples were subjected to transcriptome sequencing to obtain 138.26 GB of quality control data， which were aligned to the reference genome winter jujube. The cleans reads of the 18 samples were aligned with the reference genome. The efficiency was above 93.77%. The principal component analysis results showed that the three biological repeat samples had a higher degree of aggregation， and there was a separation phenomenon between the groups， indicating that there were differences in gene expression. After the difference analysis， the results showed that in the analysis and comparison of the fruit development of ‘Lingwuchangzao’ jujube in each period， 65， 4 509 and 1 534 differentially expressed genes were screened out in the white ripening period （JB-vs-NB）， coloring period （JZ-vs-NZ） and ripening period （JC-vs-NC）， respectively. The GO function was enriched into 50 subcategories of three categories： biological process， molecular function and cellular component. The KEGG pathway annotation significantly enriched the differentially expressed genes in secondary metabolite biosynthesis， metabolic pathway， amino acid biosynthesis and other pathways. The differentially expressed genes in mature stage were significantly enriched in sugar and acid related pathways.【Conclusion】Among five metabolic pathways related to fruit soluble sugar and total acid content， starch and sucrose metabolism， galactose metabolism， amino sugar and nucleotide sugar metabolism， glyoxylic acid and dicarboxylic acid metabolism， and butyric acid metabolism， 31 differential genes such as ncbi_107424266， ncbi_107414286， ncbi_107425230， ncbi_107429837 were screened out， which were differentially expressed in the sugar and acid metabolic pathways at different stages of fruit development， regulating the soluble sugar and total acid content in fruits at different stages.

Keywords： Lingwuchangzao jujube； root tiller reproduction； grafting propagation； differential genes

靈武長棗是寧夏重要的經(jīng)濟(jì)林樹種，是優(yōu)秀的鮮食棗品種，其果皮顏色鮮艷、口感脆甜多汁、營養(yǎng)豐富，受到廣大消費(fèi)者的青睞[1]。隨著靈武長棗產(chǎn)業(yè)的蓬勃發(fā)展，消費(fèi)者對(duì)于靈武長棗的果實(shí)品質(zhì)也提出了更高要求[2]。在實(shí)際生產(chǎn)中，靈武長棗以傳統(tǒng)的根蘗繁殖和嫁接繁殖2種方式為主進(jìn)行繁殖[3]。根蘗繁殖可以保持母樹抗旱、耐鹽堿等優(yōu)良遺傳性狀，但所生產(chǎn)的根蘗苗數(shù)量有限[4]，生長速度緩慢；而嫁接繁殖的靈武長棗植株生長快、樹勢(shì)強(qiáng)、結(jié)果早[5]，適宜于大規(guī)模發(fā)展。然而生產(chǎn)及研究中均發(fā)現(xiàn)嫁接苗的棗果風(fēng)味及營養(yǎng)品質(zhì)不如根蘗苗，2種繁殖方式各有優(yōu)劣，在生產(chǎn)中都有廣泛的應(yīng)用[6-7]。

近年來，隨著分子生物學(xué)研究技術(shù)在各個(gè)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，對(duì)于棗樹各器官的差異性研究不再局限于物候期[8-9]、土壤養(yǎng)分[10-11]及葉片光合[12-13]等生長表現(xiàn)上，在分子水平上的研究也越來越多。包括基于RNA-Seq分析鑒定棗果皮顏色相關(guān)差異基因[14]、對(duì)成熟期的靈武長棗果實(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選到調(diào)控果實(shí)糖酸的關(guān)鍵差異基因[15]等研究，但未見對(duì)不同繁殖方式下，不同時(shí)期棗果實(shí)基因表達(dá)差異研究。

本研究采集3個(gè)發(fā)育時(shí)期的靈武長棗果實(shí)提取RNA，采用高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，比較2種繁殖方式下果實(shí)基因序列的差異，篩選與根蘗和嫁接繁殖的靈武長棗果實(shí)品質(zhì)差異相關(guān)的差異基因，初步探究根蘗和嫁接繁殖靈武長棗果實(shí)營養(yǎng)品質(zhì)和基因表達(dá)差異情況，以期為后續(xù)探明2種繁殖方式的靈武長棗果實(shí)品質(zhì)差異調(diào)控機(jī)理提供基礎(chǔ)研究參考。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于寧夏靈武市千畝設(shè)施果業(yè)基地（106°15′04″E，38°04′22″N），海拔1 115 m，該地氣候類型為大陸性季風(fēng)氣候，年平均氣溫8.8 ℃，年降水量206.2～255.2 mm。

1.2 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)供試樣樹為8年生靈武長棗根蘗植株和以酸棗為砧木的靈武長棗嫁接植株（嫁接時(shí)間一致），根蘗植株平均地徑83 mm、樹高2.45 m、冠幅2.51 m×2.42 m，嫁接植株平均地徑8.9 cm、樹高2.63 m、冠幅2.53 m×2.49 m。分別選取5株生長基本一致、無病蟲害的靈武長棗根蘗植株和嫁接植株進(jìn)行果實(shí)采集，在靈武長棗果實(shí)白熟期、著色期和成熟期時(shí)，每株采集5顆果實(shí)，各時(shí)期每個(gè)處理得到25顆果實(shí)，混合后作為試驗(yàn)材料。

1.3 高通量測(cè)序及數(shù)據(jù)分析

對(duì)所得到的試驗(yàn)材料進(jìn)行隨機(jī)取樣，并設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，共18個(gè)樣品。將樣品送至廣州基迪奧生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。樣品編號(hào)分別為靈武長棗嫁接植株不同時(shí)期果實(shí)（JB、JZ、JC），靈武長棗根蘗植株不同時(shí)期果實(shí)（NB、NZ、NC）?；贗llumina Novaseq 6000測(cè)序平臺(tái)，對(duì)樣品的所有mRNA進(jìn)行測(cè)序，采用 Illumina Truse qTM RNA sample prep Kit方法進(jìn)行文庫構(gòu)建。對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)控，經(jīng)過濾后得到高質(zhì)量的Clean reads，利用Trinity軟件對(duì)得到的Clean Reads進(jìn)行拼接組裝，將測(cè)序數(shù)據(jù)以冬棗基因組為參考基因組進(jìn)行比對(duì)、注釋。利用R語言DESeq數(shù)據(jù)包篩選差異表達(dá)的基因，以FPKM=1為基因表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)，以FDR<0.05、|log2 FC|>log2 （2）作為差異基因篩選條件。利用Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（https：// www.genome.jp/kegg/）和The Gene Ontology Resource（http：//gene ontology.org/）數(shù)據(jù)庫對(duì)差異基因進(jìn)行注釋，利用R語言完成GO和KEGGpathway顯著性富集分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)量檢測(cè)

經(jīng)過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、原始數(shù)據(jù)凈化和質(zhì)量過濾，從18個(gè)靈武長棗樣品中共獲得138.26 GB數(shù)據(jù)（表1）。測(cè)序質(zhì)量在99%和99.9%以上的堿基占總堿基的百分比（Q20、Q30）分別在97.02%和91.81%以上，GC堿基含量（GC content）為43.10%～43.90%，且單個(gè)堿基位置的測(cè)序錯(cuò)誤率小于1%，說明根蘗與嫁接繁殖的靈武長棗果實(shí)各時(shí)期轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序質(zhì)量較高，數(shù)據(jù)可靠，可用于下一步數(shù)據(jù)分析。

將根蘗與嫁接繁殖的靈武長棗測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)到參考基因組冬棗（NCBI_GCF_020796205.1）上，18個(gè)樣品的Clean reads與參考基因組的比對(duì)效率（Total mapped）為93.77%～95.10%（表2），比對(duì)到參考基因組唯一位置的reads為89.73%～91.10%，2種繁殖方式的靈武長棗果實(shí)與參考基因組的匹配率都較高，證明選擇的參考基因組能夠?yàn)楸敬畏治鲈囼?yàn)提供正確可靠的背景信息。

基于表達(dá)量信息，利用R語言開展主成分分析（Principal component analysis，PCA），研究樣本間的距離關(guān)系。如圖1所示，主成分PC1的貢獻(xiàn)率為93.4%，主成分PC2的貢獻(xiàn)率為3.3%。3次生物學(xué)重復(fù)的樣本聚集程度較高，表明不同重復(fù)間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的高度重現(xiàn)性和試驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性，且不同組間存在良好的分離現(xiàn)象，說明3個(gè)生長發(fā)育時(shí)期基因表達(dá)量存在差異，為下一步試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

2.2 根蘗與嫁接繁殖靈武長棗不同時(shí)期差異基因表達(dá)量分析

不同發(fā)育時(shí)期靈武長棗果實(shí)差異基因表達(dá)量結(jié)果顯示（圖2），2種繁殖方式的果實(shí)在白熟期（JB-vs-NB）的對(duì)比中共篩選到65個(gè)差異基因，其中上調(diào)表達(dá)的基因30個(gè)，下調(diào)表達(dá)的基因35個(gè)；著色期（JZ-vs-NZ）相比，得到4 509個(gè)差異表達(dá)的基因，其中上調(diào)基因2 892個(gè)，下調(diào)基因1 617個(gè)；成熟期（JC-vs-NC）處理相比，篩選到1 534個(gè)差異基因，包括677個(gè)上調(diào)基因，857個(gè)下調(diào)基因。

通過繪制不同發(fā)育時(shí)期靈武長棗果實(shí)差異基因表達(dá)量韋恩圖（圖3）發(fā)現(xiàn)，根蘗與嫁接繁殖的靈武長棗果實(shí)在白熟期（JB-vs-NB）有39個(gè)差異基因特異表達(dá)，著色期（JZ-vs-NZ）有3 938個(gè)差異基因特異表達(dá)，成熟期（JC-vs-NC）有976個(gè)差異基因特異表達(dá)。根蘗與嫁接繁殖靈武長棗果實(shí)發(fā)育3個(gè)時(shí)期篩選出的共有差異基因有7個(gè)（表3），分別是MSTRG.1546、MSTRG.21442、MSTRG.9423、ncbi_107404917、ncbi_107423910、ncbi_107426831和ncbi_125420622，7個(gè)差異基因目前未明確注釋在KEGG途徑中，其中 ncbi_107426831和ncbi_125420622由RAV轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控表達(dá)量，相關(guān)研究表明RAV轉(zhuǎn)錄因子在植物生長發(fā)育和抗逆反應(yīng)調(diào)控中起著重要作用[16]。

2.3 根蘗與嫁接繁殖靈武長棗不同時(shí)期差異基因GO功能富集分析

根據(jù)根蘗與嫁接繁殖靈武長棗果實(shí)發(fā)育不同時(shí)期差異基因GO功能富集的結(jié)果顯示（圖4～6），3個(gè)時(shí)期差異基因均注釋到生物過程、分子功能、細(xì)胞組分3個(gè)類別中，白熟期（JB-vs-NB）、著色期（JZ-vs-NZ）、成熟期（JC-vs-NC）在GO數(shù)據(jù)庫中分別鑒定出203、20 312、7 176個(gè)差異基因。在生物過程大類中，白熟期（JB-vs-NB）差異基因主要注釋在細(xì)胞過程、代謝過程、刺激反應(yīng)、生物調(diào)節(jié)、生物過程調(diào)節(jié)、定位、發(fā)育過程等16個(gè)亞類中；著色期（JZ-vs-NZ）差異基因注釋在29個(gè)條目中；成熟期（JC-vs-NC）差異基因主要注釋有27個(gè)條目。在分子功能大類中，JB和NB組差異基因主要注釋在結(jié)合、催化活性、轉(zhuǎn)運(yùn)活性、ATP依賴性活性、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子活性、結(jié)構(gòu)分子活性等7個(gè)亞類中，JZ和NZ組差異基因注釋在18個(gè)條目中，JC和NC組中差異基因注釋在15個(gè)條目中；在細(xì)胞組分大類中，JB和NB組注釋到細(xì)胞結(jié)構(gòu)實(shí)體和含蛋白質(zhì)復(fù)合體2個(gè)亞類中，分別有21和5個(gè)差異基因，JZ和NZ、JC和NC注釋在3個(gè)亞類中，包括細(xì)胞結(jié)構(gòu)實(shí)體、含蛋白質(zhì)復(fù)合體和病毒體成分。

2.4 根蘗與嫁接繁殖靈武長棗不同時(shí)期差異基因KEGG富集分析

對(duì)根蘗與嫁接繁殖靈武長棗不同時(shí)期的差異基因進(jìn)行KEGG富集分析，結(jié)果表明，白熟期（JB-vs-NB）（圖7A）差異基因主要富集在次生代謝物生物合成、代謝途徑、類胡蘿卜素生物合成、淀粉和蔗糖代謝、乙醛酸和二羧酸代謝等通路中，著色期（JZ-vs-NZ）（圖7B）差異基因主要富集在代謝途徑、光合作用、次生代謝物生物合成、卟啉代謝等通路中，其中參與代謝途徑的基因數(shù)量最多（510個(gè)），占比56.6%；成熟期（JC-vs-NC）（圖7C）差異基因主要富集在氨基糖和核苷酸糖代謝（20，6.29%）、代謝途徑（174，54.72%）、丁酸代謝（5，1.57%）、半乳糖代謝（9，2.83%）等通路中。

2.5 果實(shí)品質(zhì)形成相關(guān)的主要差異基因篩選

根據(jù)根蘗與嫁接繁殖靈武長棗果實(shí)發(fā)育白熟期、著色期和成熟期的差異基因KEGG通路富集結(jié)果，差異顯著性較強(qiáng)的與果實(shí)可溶性糖和總酸含量密切相關(guān)的途徑有淀粉和蔗糖代謝（Starch and sucrose metabolism，ko 00500）、半乳糖代謝（Galactose metabolism，ko 01187）、氨基糖和核苷酸糖代謝（Amino sugar and nucleotide sugar metabolism，ko 13648）、乙醛酸和二羧酸代謝（Glyoxylate and dicarboxylate metabolism，ko 00630）、丁酸代謝（Butanoate metabolism，ko 00650）。本研究以這5條作為主要關(guān)注通路，根蘗與嫁接繁殖靈武長棗果實(shí)發(fā)育白熟期、著色期和成熟期3個(gè)時(shí)期分別有不同數(shù)量差異基因注釋在5條相關(guān)通路上，各通路之間互相作用、相互影響，共同構(gòu)成了根蘗與嫁接繁殖靈武長棗果實(shí)品質(zhì)差異的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制。本研究選取各通路中差異倍數(shù)排序前五的差異基因進(jìn)行展示。

2.5.1 果實(shí)發(fā)育白熟期

根蘗與嫁接繁殖靈武長棗果實(shí)發(fā)育白熟期對(duì)比，差異基因相對(duì)著色期和成熟期較少，富集在淀粉和蔗糖代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝、乙醛酸和二羧酸代謝這3條通路中的差異基因數(shù)共7個(gè)。其中在淀粉和蔗糖代謝通路中有ncbi_107410850和ncbi_107424266兩個(gè)上調(diào)基因差異表達(dá)，差異倍數(shù)分別是2.18和2.66。ncbi_107412669基因下調(diào)表達(dá)，差異倍數(shù)為4.82。氨基糖和核苷酸糖代謝通路中有ncbi_107424266一個(gè)差異基因上調(diào)表達(dá)，差異倍數(shù)為2.66倍，ncbi_107404967基因下調(diào)表達(dá)，差異倍數(shù)為34.80；乙醛酸和二羧酸代謝通路中有1個(gè)差異基因ncbi_107417353上調(diào)表達(dá)， 1個(gè)差異基因ncbi_107415024下調(diào)表達(dá)，差異倍數(shù)分別是2.33和6.67倍?？傮w上，根蘗與嫁接繁殖果實(shí)發(fā)育白熟期可溶性糖含量相關(guān)的2條主要途徑中有3個(gè)差異基因上調(diào)表達(dá)，2個(gè)基因下調(diào)表達(dá)，與總酸含量相關(guān)的1條通路中上調(diào)基因數(shù)和下調(diào)基因數(shù)均為1個(gè)。

2.5.2 果實(shí)發(fā)育著色期

根蘗與嫁接繁殖靈武長棗果實(shí)發(fā)育著色期注釋在可溶性糖和總酸相關(guān)的5條通路中的有25個(gè)差異基因，與可溶性糖相關(guān)的上調(diào)表達(dá)基因有4個(gè)，下調(diào)表達(dá)基因有11個(gè)，與總酸相關(guān)的上調(diào)表達(dá)基因有5個(gè)，下調(diào)表達(dá)基因有5個(gè)。在淀粉和蔗糖代謝途徑中，ncbi_107430563和ncbi_107432082兩個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，差異倍數(shù)分別為31.19、20.03。基因ncbi_107409332、ncbi_107430302、ncbi_112491050下調(diào)表達(dá)，差異倍數(shù)分別是19.83、22.79、28.57；在半乳糖代謝途徑中，僅ncbi_107432082基因上調(diào)表達(dá)，其余4個(gè)基因均下調(diào)表達(dá)；在氨基糖和核苷酸糖代謝途徑中，1個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，4個(gè)基因下調(diào)表達(dá)，差異倍數(shù)為4.51～19.83，在乙醛酸和二羧酸代謝途徑中，基因ncbi_107405417、ncbi_107433052和ncbi_107423244上調(diào)表達(dá)，差異倍數(shù)分別是3.38、3.54、5.78，基因ncbi_107415024和ncbi_ 107429892下調(diào)表達(dá)，差異倍數(shù)分別是3.99、3.37；丁酸代謝途徑中，2個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，差異倍數(shù)分別是3.18、3.30，3個(gè)基因下調(diào)表達(dá)，差異倍數(shù)最高為4.24。

2.5.3 果實(shí)發(fā)育成熟期

根蘗與嫁接繁殖靈武長棗果實(shí)發(fā)育成熟期在可溶性糖和總酸相關(guān)的5條通路中注釋的差異基因共有18個(gè)。與可溶性糖相關(guān)的上調(diào)表達(dá)基因有4個(gè)，下調(diào)表達(dá)基因有8個(gè)，與總酸相關(guān)的上調(diào)表達(dá)基因有1個(gè)，下調(diào)表達(dá)基因5個(gè)。淀粉和蔗糖代謝途徑中基因ncbi_125422819上調(diào)表達(dá)，差異倍數(shù)為5.51，4個(gè)差異基因下調(diào)表達(dá)，差異倍數(shù)最高為6.62；在半乳糖代謝途徑中，2個(gè)基因ncbi_107418468、ncbi_125422819均為上調(diào)表達(dá)，差異倍數(shù)分別是2.85、5.51；氨基糖和核苷酸糖代謝途徑中僅1個(gè)基因ncbi_112492524上調(diào)表達(dá)，其余4個(gè)基因均下調(diào)表達(dá)，差異倍數(shù)最高為7.49；乙醛酸和二羧酸代謝途徑中僅有1個(gè)基因ncbi_107415818下調(diào)表達(dá)，差異倍數(shù)為2.16；丁酸代謝途徑中1個(gè)差異基因ncbi_107423578上調(diào)表達(dá)，4個(gè)差異基因下調(diào)表達(dá)，差異倍數(shù)為2.00～6.07。

2.5.4 3個(gè)時(shí)期差異表達(dá)基因?qū)Ρ?/p>

在根蘗與嫁接繁殖靈武長棗果實(shí)發(fā)育白熟期、著色期和成熟期差異基因?qū)Ρ龋▓D7）中發(fā)現(xiàn)，與可溶性糖有關(guān)的淀粉和蔗糖代謝、半乳糖代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝，與總酸含量相關(guān)的乙醛酸和二羧酸代謝、丁酸代謝5條途徑中，共有31個(gè)差異基因在果實(shí)發(fā)育不同時(shí)期或同一時(shí)期不同途徑中均有富集，其中與可溶性糖相關(guān)的有28個(gè)差異基因，與總酸相關(guān)的有3個(gè)差異基因，并對(duì)這31個(gè)差異基因進(jìn)行blast分析。

31個(gè)差異基因blast分析結(jié)果（表7）表明，ncbi_ 107425230、ncbi_125422819、ncbi_107418468等5個(gè)差異基因分布在參考基因組冬棗的1號(hào)染色體上，ncbi_107405417、ncbi_107418465等4個(gè)基因分布在2號(hào)染色體上，ncbi_107422361、ncbi_112489059分布在3號(hào)染色體，ncbi_107404604分布在4號(hào)染色體上，ncbi_107420179等3個(gè)基因分布在5號(hào)染色體上，ncbi_107429837、ncbi_107430147等4個(gè)基因分布在6號(hào)染色體上，ncbi_107424266分布在7號(hào)染色體上，ncbi_107412906、ncbi_107404967等4個(gè)基因位于8號(hào)染色體上，ncbi_107409332、ncbi_107426021等4個(gè)基因位于9號(hào)染色體上，ncbi_107432082、ncbi_107435723等3個(gè)基因位于參考基因組冬棗11號(hào)染色體上。

在根蘗與嫁接繁殖靈武長棗果實(shí)發(fā)育白熟期，基因ncbi_107424266同時(shí)富集在淀粉和蔗糖代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝2條途徑中；著色期有ncbi_107414286、ncbi_107425230、ncbi_ 107429837等7個(gè)基因同時(shí)富集在淀粉和蔗糖代謝、半乳糖代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝等途徑中的至少2條途徑中。其中與可溶性糖有關(guān)的有6個(gè)差異基因，僅1個(gè)差異基因ncbi_107425230與總酸含量相關(guān)。著色期和成熟期富集在2條以上糖酸相關(guān)途徑中的差異基因共有ncbi_107409332、ncbi_107414395、ncbi_107418468和ncbi_ 107420179，2個(gè)時(shí)期共同存在差異僅富集在單條途徑上的差異基因有ncbi_107405417、ncbi_ 107412906、ncbi_107418465等16個(gè)，其中14個(gè)富集在可溶性糖含量相關(guān)途徑上，2個(gè)基因ncbi_ 107404604和ncbi_107419655富集在丁酸代謝途徑中；果實(shí)成熟期ncbi_125422819富集在淀粉和蔗糖代謝、半乳糖代謝2條途徑中，ncbi_107421126同時(shí)富集在半乳糖代謝和氨基糖和核苷酸糖代謝途徑中。果實(shí)發(fā)育白熟期和成熟期無共同富集的差異基因。

3 討 論

目前開展了一些靈武長棗轉(zhuǎn)錄組方面的研究，但轉(zhuǎn)錄組信息仍比較少，并缺少不同時(shí)期靈武長棗果實(shí)轉(zhuǎn)錄組信息。本研究發(fā)現(xiàn)根蘗和嫁接2種繁殖方式下的靈武長棗果實(shí)各發(fā)育時(shí)期間存在大量的差異表達(dá)基因，并且上、下調(diào)基因數(shù)量不等，表明果實(shí)在成熟過程中上、下調(diào)基因在基因差異表達(dá)中的促進(jìn)或抑制作用復(fù)雜。果實(shí)白熟期差異表達(dá)基因較少，著色期和成熟期差異表達(dá)基因增加。本研究中主要關(guān)注與果實(shí)中可溶性糖和總酸含量相關(guān)的代謝途徑，在淀粉和蔗糖代謝、半乳糖代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝、乙醛酸和二羧酸代謝、丁酸代謝5條途徑中篩選出了31個(gè)差異基因，為下一步探究根蘗和嫁接繁殖靈武長棗果實(shí)不同發(fā)育期糖酸等營養(yǎng)物質(zhì)含量的分子調(diào)控機(jī)制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

馬亞平等[15]研究了根蘗和嫁接靈武長棗成熟果實(shí)轉(zhuǎn)錄組之間的差異，共分析篩選出27個(gè)顯著差異表達(dá)基因，其中9個(gè)顯著上調(diào)，18個(gè)顯著下調(diào)；GO富集分析結(jié)果表明15個(gè)差異基因顯著富集到GO的三大功能類別分子功能、細(xì)胞組分、生物過程中；KEGG富集分析結(jié)果表明10個(gè)差異表達(dá)基因顯著富集到12條代謝通路中，其中包括3個(gè)上調(diào)基因和7個(gè)下調(diào)基因。進(jìn)一步篩選出調(diào)控糖及有機(jī)酸代謝關(guān)鍵差異基因BAM1、PCO和HAOX1在淀粉和蔗糖代謝、牛膽素和亞?；撬岽x、乙醛酸和二羧酸代謝中顯著表達(dá)，并在糖和有機(jī)酸的相互轉(zhuǎn)化中起著關(guān)鍵調(diào)控作用，其中，BAM1注釋信息為β-淀粉酶，PCO注釋信息為半胱氨酸氧化酶，HAOX1注釋信息為羥基酸氧化酶，均未在本研究中出現(xiàn)。

蘇媚等[17]以同一果園不同砧木的8年生嫁接香橙、紅桔和枳砧鮑威爾臍橙成熟果實(shí)作為試驗(yàn)材料，分析其生理和生化指標(biāo)及糖酸代謝相關(guān)基因的表達(dá)情況。結(jié)果表明，砧木對(duì)可食率、可滴定酸含量及果皮色澤均無明顯影響，但對(duì)臍橙果實(shí)的單果質(zhì)量、果皮厚度、可溶性固形物含量、維生素C含量、可溶性糖含量和有機(jī)酸含量存在較大影響。香橙砧臍橙的單果質(zhì)量和果皮厚度顯著大于枳砧臍橙。紅桔砧臍橙果肉中糖、酸的含量均顯著低于香橙砧和枳砧臍橙。其分子機(jī)理是紅桔砧臍橙果肉中蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因CsSUC1和CsSC4表達(dá)量低，糖酵解途徑關(guān)鍵酶之一的丙酮酸激酶基因CsPKP3表達(dá)量高；檸檬酸合成酶CsCS2表達(dá)量較低，檸檬酸降解酶谷氨酸脫羧酶基因CsGDH1和谷氨酰胺合成酶基因Cs-GH1表達(dá)量高。類似的研究也表明，葡萄和蘋果都有幾個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子參與果皮花色素苷的生物合成，有時(shí)也與 b HLH和WD40相互影響[18]。在對(duì)“泰山紅”和“牡丹”2個(gè)石榴品種成熟期果實(shí)轉(zhuǎn)錄組的研究中發(fā)現(xiàn)，鑒定出參與石榴果實(shí)糖酸代謝的關(guān)鍵基因有17個(gè)，‘泰山紅’中FRK、SS、BGLU、UXS、FBA和ADH基因的表達(dá)量高于‘牡丹’[19]。石榴果實(shí)中，葡萄糖和果糖是主要的糖組分，酸以檸檬酸和蘋果酸為主，差異基因在糖酸代謝中如何調(diào)控還需進(jìn)一步研究。

植物細(xì)胞轉(zhuǎn)錄表達(dá)后，涉及轉(zhuǎn)錄后修飾[20]、蛋白質(zhì)翻譯[21]、翻譯后修[22-23]的過程，轉(zhuǎn)錄結(jié)果才能在代謝水平上呈現(xiàn)。轉(zhuǎn)錄組是基因表達(dá)的媒介，而代謝組反映細(xì)胞表型和功能的變化[24]。本研究中主要對(duì)根蘗與嫁接繁殖的靈武長棗在果實(shí)發(fā)育時(shí)期存在的差異基因進(jìn)行了初步探究，其在代謝物水平也可能存在一定差異，后續(xù)研究中可以進(jìn)一步探討代謝物水平的異同之處，并可分析其代謝調(diào)控的分子機(jī)制。

4 結(jié) 論

基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，根蘗與嫁接繁殖靈武長棗果實(shí)發(fā)育各時(shí)期組間分析對(duì)比中，果實(shí)白熟期（JB-vs-NB）、著色期（JZ-vs-NZ）、成熟期（JC-vs-NC）各組間分別鑒定出65、4 509和1 534個(gè)差異基因。GO功能富集到生物過程、分子功能和細(xì)胞組分三大類中的50個(gè)亞類中，KEGG通路注釋將差異基因顯著富集在次生代謝物生物合成、代謝途徑和氨基酸生物合成等通路中，成熟期差異基因富集在糖酸相關(guān)通路的顯著性較高。

根蘗與嫁接繁殖靈武長棗果實(shí)發(fā)育白熟期、著色期和成熟期果實(shí)在淀粉和蔗糖代謝、半乳糖代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝、乙醛酸和二羧酸代謝、丁酸代謝5條與果實(shí)可溶性糖和總酸含量相關(guān)的代謝途徑中篩選出了ncbi_107424266、ncbi_107414286、ncbi_107425230、ncbi_107429837等31個(gè)差異基因，分別在果實(shí)發(fā)育不同時(shí)期的糖酸代謝途徑中差異表達(dá)，調(diào)控各時(shí)期果實(shí)中可溶性糖及總酸含量。

參考文獻(xiàn)：

[1] 李百云，李慧.靈武長棗早熟優(yōu)系選育[J].果樹資源學(xué)報(bào)， 2021，2（6）：81-86. LI B Y， LI H. Breeding of early maturing superior lines of Lingwu long jujube[J]. Journal of Fruit Tree Resources，2021，2（6）：81-86.

[2] 院欽，張欣，任玉鋒，等.冷棚栽培對(duì)靈武長棗果實(shí)品質(zhì)的影響[J].中國南方果樹，2023，52（5）：170-174. YUAN Q， ZHANG X， REN Y F， et al. Effect of cold shed cultivation on fruit quality of Lingwu long jujube[J]. South China Fruits Trees，2023，52（5）：170-174.

[3] 李振強(qiáng)，馬旭，田應(yīng)明，等.不同施氮量對(duì)靈武長棗各發(fā)育階段果實(shí)品質(zhì)的影響[J].經(jīng)濟(jì)林研究，2022，40（4）：124-132. LI Z Q， MA X， TIAN Y M， et al. Effects of different nitrogen rates on fruit quality of Lingwuchangzao at different developmental stages[J]. Non-wood Forest Research，2022，40（4）：124-132.

[4] ZHANG Z， WEI T J， ZHONG Y， et al. Construction of a highdensity genetic map of Ziziphus jujuba Mill. using genotyping by sequencing technology[J]. Tree Genetics Genomes，2016， 12（4）：76.

[5] GAIKWAD S P， CHALAK S U， KAMBLE A B. Effect of spacing on growth， yield and quality of mango[J]. Journal of Krishi Vigyan，2017，5（2）：50-53.

[6] 萬仲武，芮長春，張治業(yè).靈武長棗物候期與氣溫和地溫的關(guān)系研究[J].北方園藝，2013（15）：47-50. WAN Z W， RUI C C， ZHANG Z Y. Study on relationship between phonological period and air temperature， soil temperature of Zizyphus jujube Mill cv. Lingwuchangzao[J]. Northern Horticulture，2013（15）：47-50.

[7] 紀(jì)晴，石倩倩，徐世宏，等.棗產(chǎn)品開發(fā)現(xiàn)狀及未來趨勢(shì)研究[J].農(nóng)村經(jīng)濟(jì)與科技，2015，26（7）：11-12，20. JI Q， SHI Q Q， XU S H， et al. Research on the current situation and future trend of jujube product development[J]. Rural Economy of Science and Technology，2015，26（7）：11-12，20.

[8] 陳麗華，楊喜盟，賈昊，等.氣溫升高與干旱對(duì)靈武長棗果實(shí)糖積累、蔗糖代謝關(guān)鍵酶及相關(guān)基因表達(dá)的影響[J].核農(nóng)學(xué)報(bào)，2020，34（9）：2112-2123. CHEN L H， YANG X M， JIA H， et al. Effects of elevated temperature and drought on sugar accumulation， key sucrose enzymes metabolism and related gene expression in fruit of jujube cultivar Lingwuchangzao[J]. Journal of Nuclear Agricultural Sciences，2020，34（9）：2112-2123.

[9] BI X Y， LIAO L， DENG L J， et al. Combined transcriptome and metabolome analyses reveal candidate genes involved in Tangor（Citrus reticulate×Citrus sinensis） fruit development and quality formation[J]. Molecular Sciences，2022，23（10）：5457.

[10] 李振強(qiáng).根蘗與嫁接繁殖對(duì)靈武長棗生長、葉片性狀及根系生長的影響[D].銀川：寧夏大學(xué)，2022. LI Z Q. Effects of tiller propagation and graft propagation on growth， leaf traits and root growth of ‘Lingwuchangzao’[D]. Yinchuan： Ningxia University，2022.

[11] 劉豐鳴，黃瑤，劉偉鋒，等.施肥對(duì)阿克蘇地區(qū)駿棗園土壤、葉片養(yǎng)分及棗果品質(zhì)的影響[J].經(jīng)濟(jì)林研究，2023，41（1）： 106-116. LIU F M， HUANG Y， LIU W F， et al. Effect of fertilization on soil nutrients， leaf nutrients and fruit quality of Jun jujube inAksu[J]. Non-wood Forest Research，2023，41（1）：106-116.

[12] KRONER G M， THOMAS R L， JOHNSON-DAVIS K L. Retrospective analysis of pediatric and adult populations using an LC-MS/MS method for Oxcarbazepine /Eslicarbazepine metabolite[J]. The Journal of Applied Laboratory Medicine，2020，6（3）： 637-644.

[13] 禹瑞麗，劉佳嘉，吳國偉，等.靈武長棗根蘗苗與嫁接苗葉片光合特性的比較[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2023，43（9）：70-79. YU R L， LIU J J， WU G W， et al. Comparison of photosynthetic characteristics between the root tiller seedlings and grafted seedlings of Ziziphus jujube ‘Lingwuchangzao’[J]. Journal of Central South University of Forestry Technology，2023，43（9）： 70-79.

[14] 韓雅茹.氣溫升高與干旱互作下靈武長棗果皮花青苷合成的代謝調(diào)控機(jī)制[D].銀川：寧夏大學(xué)，2023. HAN Y R. Metabolic regulation mechanism of anthocyanin synthesis in the pericarp of Zipiphus jujuba Mill cv.‘Lingwuchangzao’ under interaction of elevated temperature and drought stress[D]. Yinchuan： Ningxia University，2023.

[15] 馬亞平，白琳云，徐偉榮，等.靈武長棗嫁接和根蘗繁殖植株果實(shí)轉(zhuǎn)錄組差異分析[J].分子植物育種，2021，19（16）：5297-5306. MA Y P， BAI L Y， XU W R， et al. Transcriptome differences analysis of fruit of grafting and root tiller propagation of‘Lingwuchangzao’ jujube[J]. Molecular Plant Breeding，2021，19（16）： 5297-5306.

[16] ZHANG C W， WANG X Y， LI H W， et al. GLRaV-2 protein p24 suppresses host defenses by interaction with a RAV transcription factor from grapevine[J]. Plant Physiology，2022，189（3）： 1848-1865.

[17] 蘇媚，伊華林.砧木對(duì)臍橙果實(shí)品質(zhì)及糖酸代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響[J].中國南方果樹，2016，45（5）：34-37. SU M， YI H L. Effects of rootstocks on fruit quality and expression of genes related to sugar and acid metabolism in navel orange[J]. South China Fruits，2016，45（5）：34-37.

[18] 程嬌.MeSA處理調(diào)控桃形李采后果實(shí)花色苷合成代謝的研究[D].浙江：浙江工商大學(xué)，2022. CHENG J. MeSA regulates anthocyanin anabolism in postharvest taoxingli plum[D]. Hangzhou： Zhejiang Gongshang University，2022.

[19] 馮立娟，付瑩，王傳增，等.基于RNA-Seq鑒定不同石榴品種間果實(shí)糖酸代謝基因[J].植物生理學(xué)報(bào)，2022，58（6）：1161-1172. FENG L J， FU Y， WANG C Z， et al. Identification of sugar and acid metabolism genes in different pomegranate （Punica granatum） cultivars based on RNA-Seq[J]. Plant Physiology Journal，2022，58（6）： 1161-1172.

[20] CHAUDHARY S， JABRE I， REDDY A S N， et al. Perspective on alternative splicing and proteome complexity in plants[J]. Trends in Plant Science，2019，24（6）：496-506.

[21] KWANUK L， HUNSEUNG K. Emerging roles of RNA-binding proteins in plant growth， development， and stress responses[J]. Molecules and Cells，2016，39（3）：179-185.

[22] WASZCZAK C， AKTER S， JACQUES S， et al. Oxidative posttranslational modifications of cysteine residues in plant signal transduction[J]. Journal of Experimental Botany，2015，66（10）： 2923-2934.

[23] XU S L， CHALKLEY R J， MAYNARD J C， et al. Proteomic analysis reveals O-GlcNAc modification on proteins with key regulatory functions in Arabidopsis[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2017，114（8）： 1536-1543.

[24] 蔡凈蓉，王杰，趙俊躍，等.成熟期不同橄欖品種（系）果實(shí)代謝組及其差異[J].熱帶作物學(xué)報(bào)，2022，43（11）：2304-2315. CAI J R， WANG J， ZHAO J Y， et al. Metabolomics and its difference of Chinese olive fruit of different varieties （lines） during the ripening period[J]. Journal of Tropical Crops，2022，43（11）： 2304-2315.

[本文編輯：吳 彬]